The miR-338-3p expression level in pemphigus diagnosis

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Аутоиммунная пузырчатка представляет собой группу редких и потенциально смертельных хронических дерматозов. В результате фиксации аутоантител к десмоглеину 3 и/или 1 (Dsg3, Dsg1) в эпидермисе при аутоиммунной пузырчатке происходит образование внутриэпидермальных полостей за счёт акантолиза кератиноцитов, что клинически проявляется возникновением пузырей на коже и слизистых оболочках [1].

Распространённость аутоиммунной пузырчатки сильно варьирует в зависимости от географического региона: чаще всего заболевание встречается на Индийском субконтиненте, в Средиземноморском регионе и на Ближнем Востоке. Заболеваемость аутоиммунной пузырчаткой в России составляет 1,9 случая на 100 000 населения в год [2]. Наиболее часто встречающиеся виды аутоиммунной пузырчатки ― вульгарная и листовидная, на долю которых приходится 90–95% всех вариантов заболевания [3]. Вульгарная пузырчатка является наиболее распространённым типом аутоиммунной пузырчатки и составляет до 65% всех случаев [4, 5]. Среди пациентов преобладают женщины, соотношение мужчин и женщин составляет от 1:1,7 до 1:1,1 [1–5]. Почти во всех случаях вульгарной пузырчатки в течение болезни развиваются поражения слизистой оболочки полости рта, при этом более чем в 50–70% случаев манифестация происходит именно при этой локализации [6, 7]. Листовидная пузырчатка ― второй по частоте встречаемости вид аутоиммунной пузырчатки: её распространённость составляет до 27% всех случаев [8].

В связи с редкостью заболевания и зачастую длительным дифференциально-диагностическим поиском от момента манифестации до постановки диагноза может пройти несколько недель и даже месяцев, что приводит к отсрочке патогенетической терапии и утяжелению течения болезни [9–14]. Стандартом диагностики аутоиммунной пузырчатки являются наличие характерной клинической картины, гистологическое исследование, а также проведение прямой и непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и/или иммуноферментного анализа (ИФА; enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), однако наличие ложноположительных и ложноотрицательных результатов при гистологическом и иммуногистохимическом исследовании по-прежнему делает актуальной проблему поиска новых диагностических методов [15].

В настоящее время проводится широкий спектр исследований для поиска методов контроля активности заболевания с помощью различных биомаркеров, которые могут быть использованы для мониторинга прогрессирования аутоиммунной пузырчатки и прогноза ответа на терапию, что позволит оптимизировать выбор персонализированной терапии [16]. Особенно перспективной считалась оценка тяжести аутоиммунной пузырчатки по уровню титра аутоантител к Dsg1 и Dsg3, однако теория показала свою неэффективность, поскольку титр антител может оставаться высоким и при клинической ремиссии [17, 18]. В последние годы в качестве метода диагностики и прогнозирования исходов заболеваний активно изучаются микроРНК [19].

МикроРНК ― это некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые контролируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне [20]. Согласно последним данным, в геноме человека насчитывается 2675 зрелых микроРНК, которые служат потенциальным регулятором более 60% кодирующих генов [21, 22]. МикроРНК связываются с целевыми мессенджерными РНК (мРНК), вызывая деградацию или трансляционную супрессию мРНК и впоследствии регулируют различные биологические процессы, включая апоптоз, дифференцировку клеток, межклеточные коммуникации и реакции иммунного ответа [23]. Дисрегуляция микроРНК играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, способствуя аутореактивности Т-клеток, активируя воспалительные пути и продукцию цитокинов, а также регулируя активацию В-клеток и индуцируя апоптоз [24–26].

Результаты исследований последних лет указывают на то, что класс регуляторных биомолекул микроРНК благодаря тканеспецифичной экспрессии, а также способности быстро выходить из клеток и оставаться стабильными в биологических жидкостях могут превосходить по чувствительности и специфичности существующие биомаркеры [27], однако публикаций, посвящённых изучению экспрессии микроРНК в контексте аутоиммунной пузырчатки, на данный момент ограниченное количество (табл. 1) [28–34].

В опубликованных на сегодняшний день работах была проанализирована экспрессия суммарно более 170 микроРНК (см. табл. 1), при этом особое значение было уделено miR-338-3p, поскольку экспериментально установлено, что данная микроРНК подавляет продукцию интерферона-гамма и повышает уровень интерлейкинов (interleukin, IL) 4 и 10 [31]. Следовательно, изменённая экспрессия miR-338-3p может быть пусковым фактором в дисбалансе Th1/Th2 клеток, который лежит в основе теории патогенеза аутоиммунной пузырчатки [35–37].

Эффективным методом для количественного определения относительных и абсолютных уровней микроРНК в биологических образцах является полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ), так как метод обладает высокой точностью и чувствительностью [38], однако на сегодняшний день между исследованиями наблюдается большая вариабельность в отношении количества анализируемых микроРНК (от 1 до 124), вариантов модификации ПЦР и детекции результатов методом ПЦР-РВ. Открытым остаётся также вопрос выбора субстратов для проведения исследования (плазма крови, мононуклеарные клетки, экзосомы, биоптаты кожи), а также выбора внутреннего контроля для анализа экспрессии (см. табл. 1). Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии стандарта протокола для оценки уровня экспрессии микроРНК при аутоиммунной пузырчатке.

 

Таблица 1. Сравнение публикаций по изучению экспрессии микроРНК при аутоиммунной пузырчатке

Table 1. Comparison of studies on microRNA expression in pemphigus

Публикация| Publication	Фенотип| Phenotype	Общее число изученных микроРНК| Total number  of microRNAs studied	Ключевые микроРНК | Key miRNAs	Субстрат| Substrate	Метод детекции| Detection method	Внутренний контроль| Internal control
Valentino и соавт., 2023 [28]	ВП	86	hsa-miR-148a-3p hsa-miR-146b-5p hsa-miR-126 hsa-miR-139	Экзосомы, полученные из плазмы крови	ПЦР-РВ TaqMan	U6
Khabou и соавт., 2023 [29]	ЛП	6	hsa-miR-17-5p hsa-miR-21-5 hsa-miR-146a-5p hsa-miR-155-5p hsa-miR-338-3p hsa-miR-21	Мононуклеарные  клетки периферической  крови/ биоптаты кожи	ПЦР-РВ*	*
He и соавт., 2022 [30]	ВП	12	hsa-miR-125b-5p hsa-miR-146a-5p hsa-miR-148a-3p hsa-miR-150-5p hsa-miR-155-5p hsa-miR-181a-5p hsa-miR181b-5p hsa-miR-326 hsa-miR-338-3p hsa-miR-423-5p hsa-miR-424-5p hsa-miR-584-5p	Плазма крови	ПЦР-РВ SYBR Green I	5S рРНК
Xu и соавт., 2020 [31]	ВП	1	hsa-miR-338-3p	Мононуклеарные  клетки периферической крови	ПЦР-РВ SYBR Green I	U6
Lin и соавт., 2018 [32]	ВП	1	hsa-miR-338-3p	Мононуклеарные клетки периферической крови	ПЦР-РВ SYBR Green I	U6
Liu и соавт., 2018 [33]	ВП	1	hsa-miR-338-3p	Мононуклеарные клетки периферической крови	ПЦР-РВ SYBR Green I	18srRNA
Wang и соавт., 2017 [34]	ВП	124	hsa-miR-424-5p	Мононуклеарные клетки периферической крови	ПЦР-РВ SYBR Green I	U6

Примечание. * Подробная информация о методе не доступна. ВП ― вульгарная пузырчатка; ЛП ― листовидная пузырчатка; ПЦР-РВ ― полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Note. * Detailed information on the method is not available. ВП ― pemphigus vulgaris; ЛП ― pemphigus foliaceus; ПЦР-РВ ― real-time polymerase chain reaction.

 

Цель исследования ― разработать технологию оценки уровня экспрессии miR-338-3p в мононуклеарных клетках периферической крови и оценить диагностическую ценность экспрессии miR-338-3p для аутоиммунной пузырчатки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Экспериментальное проспективное сравнительное.

Критерии соответствия

Критерии включения: лица обоих полов; впервые или ранее установленные диагнозы «Вульгарная пузырчатка» или «Листовидная пузырчатка»; возраст пациентов от 18 лет; добровольное желание пациента и наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании; согласие на обработку персональных данных.

Критерии включения в группу контроля: лица обоих полов; возраст от 18 лет; желание добровольца и наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании; согласие на обработку персональных данных.

Критерии невключения: несоответствие критериям включения; наличие тяжёлых сопутствующих или других аутоиммунных заболеваний в анамнезе; беременность и период лактации; отказ пациента от участия в исследовании.

Критерии невключения в группу контроля: несоответствие критериям включения; наличие тяжёлых сопутствующих или других аутоиммунных заболеваний в анамнезе; нежелание добровольца участвовать в исследовании.

Критерии исключения: желание пациента прекратить участие в исследовании.

Критерии исключения для группы контроля: желание добровольца прекратить участие в исследовании.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе Клиники кожных и венерических болезней имени В.А. Рахманова ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России. Все пациенты подписали информированное добровольное согласие перед включением в исследование и согласие на обработку персональных данных. Исследуемый материал (кровь) транспортировался при температуре 4^оС в лабораторию при кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии имени академика П.В. Сергеева медико-биологического факультета ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось в период с февраля 2023 по февраль 2024 года.

Описание медицинского вмешательства

В исследование включены 10 пациентов с диагнозом аутоиммунной пузырчатки в активной стадии заболевания, из них 6 с вульгарной формой, 4 ― с листовидной, и 3 пациента с диагнозом вульгарной пузырчатки в стадии ремиссии (более 2 лет), получающих поддерживающую дозу системных глюкокортикоидов (10 мг). Оценка степени тяжести заболевания проводилась с помощью индекса площади поражения при пузырчатке (pemphigus disease area index, PDAI). Характеристики пациентов представлены в табл. 2 . Группа контроля включала 9 условно здоровых добровольцев.

Диагноз аутоиммунной пузырчатки устанавливался на основании клинической картины, данных анамнеза пациента, наличия антител в сыворотке крови к Dsg1 и Dsg3, результатов гистологического исследования (интраэпидермальный, супрабазальный акантолиз с образованием щелевидных полостей, содержащих акантолитические клетки) и реакции прямой иммунофлюоресценции (фиксация IgG и С3 компонента комплемента на уровне межклеточных связей клеток шиповатого слоя эпидермиса).

После подтверждения диагноза пациенты находились на стационарном лечении в дерматовенерологическом отделении Клиники кожных и венерических болезней имени В.А. Рахманова Сеченовского Университета. При госпитализации в стационар у пациентов производился отбор периферической венозной крови в пробирки с аэрозольным покрытием антикоагулянтом ЭДТА К2. В течение не более 5 часов после взятия образца крови происходило выделение мононуклеарных клеток периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл (плотность 1,077 г/см³) (ПанЭко, Россия) в виде интерфазного кольца. Полученные мононуклеарные клетки периферической крови помещали в криопробирки и хранили при -80ºC до дальнейшей обработки.

МикроРНК из мононуклеарных клеток выделяли с использованием набора для выделения суммарной РНК и микроРНК из реагента «Лира» (Биолабмикс, Россия) согласно методике производителя. Комплементарную ДНК (кДНК) получали на основе технологии StemLoop с использованием набора для обратной транскрипции «ОТ-1» (Синтол, Россия). Реакцию проводили раздельно для miRNA-338-3p и U6 (малая ядерная РНК) с использованием подобранных и синтезированных специфичных RT-праймеров (Синтол, Россия) (табл. 3). Реакционная смесь содержала по 10 мкл 2,5 X Реакционной смеси, 1 мкл специфического праймера для обратной транскрипции, 1 мкл фермента MMLV, 3 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 10 мкл раствора РНК. Реакцию проводили по программе: 37^оС ― 30 минут, 95^оС ― 5 минут с последующим охлаждением смеси.

Исследование экспрессии miRNA-338-3p проводили для каждого исследуемого образца триплетами с помощью ПЦР-РВ с использованием набора «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия) в конечном объёме 25 мкл. В ходе проводимых ПЦР-РВ с образцами пациентов экспериментально установлено, что оптимальными для получения пиков плавления и кривых плавления на уровне не менее 1000 относительных единиц флуоресценции в ПЦР-РВ для подобранных последовательностей прямых и обратных праймеров (см. табл. 3), а также исследуемой кДНК служит разведение кДНК и синтезированных праймеров в 5 раз. Конечная смесь для ПЦР в расчёте на одну пробирку объёмом 25 мкл содержала 10 мкл 2,5х Реакционной смеси + SYBR Green I; 1 мкл смеси праймеров по 10 пмоль/мкл прямого и обратного в 5-кратном разведении; 0,5 мкл MgCl₂ 25 мМ; 1 мкл исследуемой кДНК в 5-кратном разведении; 12,5 мкл dd H₂O. Программа амплификации была следующей: 10 минут при 95^оС; далее по 30 секунд 40 циклов при 95^оС, 20 секунд при 60^оС, 1 минута при 72^оС; затем 1 цикл 5 минут при 95^оС. Амплификация проводилась на приборе Bio-Rad iCycler iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Оценка уровня экспрессии miRNA-338-3p основывалась на её сравнении с экспрессией малой ядерной РНК U6, которая использовалась в качестве контроля благодаря стабильности уровня экспрессии. Интенсивность сигнала выражалась в относительных единицах флуоресценции. Для каждого образца были построены две кривые накопления флуоресцентного сигнала ― miRNA-338-3p и U6. Результатом ПЦР-РВ являлось значение порогового цикла (cycle threshold, Ct) ― число циклов, необходимых для пересечения флуоресцентным сигналом порога (фонового уровня), поскольку уровень Ct обратно пропорционален количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (чем ниже уровень Ct, тем выше количество нуклеиновой кислоты-мишени в образце).

Этическая экспертиза

Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый МГМУ имени И.М. Сеченова» Минздрава России (протокол № 02-23 от 26.01.2023).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel, GraphPad Prism 10.1.1, а также Jamovi 2.3.28. Расчёт относительного уровня экспрессии miR-338-3p проводили по стандартной методике 2^-ΔΔСt [39].

Для оценки нормальности распределения в группах использовали критерий Шапиро–Уилка, для оценки однородности генеральной совокупности ― тест однородности дисперсии Левена. Для обнаружения различий между группами использовали апостериорный тест Геймса–Хауэлла. Достоверность различий средних значений уровней экспрессии в трёх группах оценивали при помощи t-теста Стьюдента для независимых выборок. Корреляционный анализ проводили при помощи коэффициента корреляции Спирмена и Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследование включены 10 пациентов в активной стадии заболевания: 6 (60%) с диагнозом вульгарной пузырчатки и 4 (40%) с диагнозом листовидной пузырчатки. У 7/10 (70%) пациентов диагностирована средняя степень тяжести по индексу PDAI, у 3 (30%) ― тяжёлая степень. У 9 (90%) пациентов отбор материала для исследования производился до начала патогенетической терапии системными глюкокортикоидами; 1 (10%) пациент получал терапию глюкокортикоидами в дозе 15 мг. В группу входили 5 (50%) мужчин и 5 (50%) женщин, что соответствует соотношению 1:1; средний возраст составил 46±10,7 года. Подробные характеристики указаны в табл. 2.

 

Таблица 2. Клиническая характеристика пациентов с аутоиммунной пузырчаткой в активной стадии заболевания

Table 2. Clinical characteristic of patients with pemphigus in active stage of the disease

Номер пациента| Patient number	Пол | Gender	Возраст, лет | Age, years	Диагноз | Diagnosis	Наличие высыпаний на коже/слизистых оболочках | Presence of rashes on the skin/mucous membranes	Доза ГКС, мг | Glucocorticoid dose, mg	PDAI	Степень тяжести | Disease severity
1	М	53	ВП	Кожа/слизистые	0	66	Тяжёлая
2	М	52	ЛП	Кожа	0	22	Средняя
3	М	36	ВП	Кожа/слизистые	0	81	Тяжёлая
4	Ж	45	ВП	Кожа/слизистые	15	37	Средняя
5	Ж	64	ЛП	Кожа	0	20	Средняя
6	Ж	56	ВП	Кожа/слизистые	0	34	Средняя
7	Ж	30	ЛП	Кожа	0	25	Средняя
8	М	38	ВП	Кожа/слизистые	0	30	Средняя
9	Ж	52	ВП	Кожа/слизистые	0	98	Тяжёлая
10	М	38	ЛП	Кожа	0	19	Средняя

Примечание. ВП ― вульгарная пузырчатка; ЛП ― листовидная пузырчатка; ГКС ― глюкокортикоид; PDAI ― индекс площади поражения при пузырчатке.

Note. ВП ― pemphigus vulgaris; ЛП ― pemphigus foliaceus; PDAI ― pemphigus disease area index.

 

Таблица 3. Нуклеотидные последовательности праймеров

Table 3. Primer nucleotide sequences

Праймер | Primer	Нуклеотидная последовательность | Nucleotide sequence
Праймеры для обратной транскрипции | Reverse transcription primers
RT-oligo-miR-338-3p	5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGTCG-3’
RT-oligo-U6	5’-GTCGTGTCTGAGGCTGACTGAGACCTATTCGCACCTGACACGACGGCCATGC-3’
Амплификационные праймеры | Amplification primers
Forward-miR-338-3p	5’-TACGTTGTTTTAGTGACTACGACCT-3’
Reverse-miR-338-3p	5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’
Forward-U6	5’-GGCCGCATACAGAGAAGATTA-3’
Reverse-U6	5’-CTGAGGCTGACTGAGACCT-3’

 

В группу пациентов в стадии ремиссии вошло 3 человека: 2 (66,7%) женщины и 1 (33,3%) мужчина, средний возраст 57±8 лет. У всех трёх пациентов поддерживающая доза глюкокортикоидов составляла 10 мг.

В группу контроля были включены 9 условно здоровых добровольцев: 8 (88,9%) женщин и 1 (11,1%) мужчина; средний возраст 36±16,8 года.

Основные результаты исследования

Результаты экспрессии miR-338-3p в мононуклеарных клетках пациентов в активной стадии заболевания, пациентов в ремиссии, а также условно здоровых добровольцев представлены в табл. 4–6.

 

Таблица 4. Относительный уровень экспрессии miR-338-3p в мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с аутоиммунной пузырчаткой в активной стадии заболевания

Table 4. Relative expression levels of miR-338-3p in peripheral blood mononuclear cells of patients with active pemphigus

Номер пациента | Patient number	miR-338-3p Ct	U6 Ct	ΔСt	ΔΔСt	2-ΔΔCt
1	8,13	18,65	-10,52	-3,28	9,710
2	10,52	20,36	-9,84	-2,60	6,047
3	9,82	21,05	-11,24	-3,99	15,902
4	12,49	20,88	-8,40	-1,15	2,221
5	9,67	18,9	-9,23	-1,99	3,962
6	10,04	20,25	-10,22	-2,97	7,841
7	11,77	22,63	-10,86	-3,61	12,219
8	11,92	21,41	-9,49	-2,25	4,744
9	7,84	19,38	-11,54	-4,30	19,645
10	11,56	20,83	-9,27	-2,03	4,073
Среднее значение | Mean					8,636

 

Таблица 5. Относительный уровень экспрессии miR-338-3p в мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с аутоиммунной пузырчаткой в стойкой ремиссии

Table 5. Relative expression levels of miR-338-3p in peripheral blood mononuclear cells of patients with pemphigus in remission

Номер пациента | Patient number	miR-338-3p Ct	U6 Ct	ΔСt	ΔΔСt	2-ΔΔCt
1	13,85	22,05	-8,20	-0,96	1,945
2	12,03	21,0	-9,00	-1,75	3,366
3	13,47	23,0	-9,52	-2,27	4,827
Среднее значение | Mean					3,379

 

Таблица 6. Относительный уровень экспрессии miR-338-3p в мононуклеарных клетках периферической крови условно здоровых добровольцев

Table 6. Relative expression levels of miR-338-3p in peripheral blood mononuclear cells of control group of healthy volunteers

Номер пациента | Patient number	miR-338-3p Ct	U6 Ct	ΔСt	ΔΔСt	2-ΔΔCt
1	24,02	30,6	-6,54	0,71	0,612
2	24,62	31,2	-6,63	0,62	0,651
3	25,78	29,4	-3,61	3,63	0,081
4	22,50	30,6	-8,06	-0,81	1,755
5	17,39	26,5	-9,10	-1,86	3,620
6	19,93	28,5	-8,55	-1,31	2,473
7	18,65	26,4	-7,73	-0,48	1,396
8	19,15	25,9	-6,73	0,52	0,698
9	22,84	31,1	-8,27	-1,03	2,037
Среднее значение | Mean					1,480

 

Средний уровень экспрессии miR-338-3p в группе пациентов в активной стадии заболевания составил 8,64 (SD±5,72), в группе пациентов в стадии ремиссии ― 3,38 (SD±1,44), в группе контроля ― 1,48 (SD±1,12) (рис. 1). Во всех трёх группах наблюдалось нормальное распределение согласно тесту Шапиро–Уилка: p=0,27; p=0,98 и p=0,58 соответственно. На основе теста однородности дисперсии Левена и апостериорного теста Геймс–Хауэлла обнаружена разница средних уровней экспрессии между группой пациентов в активной стадии заболевания и группой контроля (p=0,008). Выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии miR-338-3p у пациентов в активной стадии заболевания по сравнению с группой условно здоровых добровольцев (p=0,002, размер эффекта 1,69) (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Средний уровень экспрессии miR-338-3p. Группы: 1 ― пациенты в активной стадии заболевания; 2 ― пациенты в стойкой ремиссии; 3 ― контроль (группа условно здоровых добровольцев).

Fig. 1. Mean expression level of miR-338-3p. Groups: 1 ― patients with active stage of the disease; 2 ― patients in remission; 3 ― control group of healthy volunteers.

 

При корреляционном анализе с использованием коэффициента корреляции Спирмена и Пирсона установлена статистически значимая связь между уровнем экспрессии miR-338-3p и величиной индекса PDAI (Спирмен: r=0,624, p=0,030; Пирсон: r=0,834; p <0,001) (рис. 2).

 

Рис. 2. Связь между уровнем экспрессии miR-338-3p и величиной индекса PDAI.

Fig. 2. Correlation between miR-338-3p expression level and PDAI index score.

 

Достоверного различия уровня экспрессии miR-338-3p между группой пациентов в стадии ремиссии и группой пациентов в активной стадии заболевания не выявлено (p=0,153, размер эффекта 1,01), однако наблюдалось различие между группой пациентов в стадии ремиссии и группой контроля (p=0,038, размер эффекта 1,60). Отсутствие различий между группой пациентов в стадии ремиссии и группой пациентов в активной стадии заболевания может быть обусловлено сильной неравномерностью двух данных выборок, а также малой выборкой пациентов в стадии ремиссии.

ОБСУЖДЕНИЕ

Аутоиммунная пузырчатка ― группа тяжёлых, прогрессирующих дерматозов. При отсутствии своевременной патогенетической терапии исход заболевания может быть летальным. В настоящее время диагностика аутоиммунной пузырчатки преимущественно основывается на оценке совокупности клинических проявлений, гистологической картины, результатах ИФА (ELISA), прямой/непрямой РИФ, а золотым стандартом являются исследование биоптата с помощью прямой РИФ с визуализацией межклеточного отложения иммуноглобулина G (immunoglobulin G, IgG) и/или регулятора системы комплемента C3 в эпидермисе, а также патоморфологическое исследование биоптата кожи на границе пузыря и видимо неизменённой кожи [15]. Однако часто данные методы из-за отсутствия соответствующей лабораторной оснащённости и высокой стоимости оказываются недоступными в клинической практике. Так, патоморфология и прямая РИФ достаточно трудоёмки и требуют значительных временных затрат, что при этом не исключает ложноотрицательных результатов [40].

Метод ИФА (ELISA) приобрёл широкое распространение и значение в диагностике аутоиммунной пузырчатки благодаря высокой чувствительности и специфичности, однако и здесь возможны как ложноотрицательные [41], так и ложноположительные результаты [42]. Кроме того, в одном из исследований, сообщалось о наличии положительных анти-Dsg-3 антител среди здоровой популяции жителей Египта [43]. Недавним открытием в диагностике пузырчатки стал метод непрямой РИФ с помощью тест-системы BIOСHIP (Dermatology Mosaic 7, EuroImmun, Lubeck, Германия), которая отличается упрощённым протоколом использования и более низкой стоимостью по сравнению с методом ИФА, а также высокой чувствительностью и специфичностью [44]. Однако технология BIOСHIP не получила широкого распространения и требует валидации на основе исследований с бΌльшим объёмом выборки [45].

Таким образом, современные методы диагностики позволяют поставить правильный диагноз в большинстве случаев, однако частота постановки ошибочного диагноза остаётся высокой, что в результате приводит к быстрому прогрессированию заболевания и развитию тяжёлых осложнений в связи с откладыванием начала терапии, поэтому по-прежнему актуальной остаётся проблема поиска новых диагностических методов аутоиммунной пузырчатки.

Одним из новых направлений современных исследований по поиску новых биомаркеров являются микроРНК [19]. МикроРНК доказано стабильны in vivo, поскольку устойчивы к воздействию РНКаз, циклам замораживания/оттаивания и значительным колебаниям pH [46], а также к длительной инкубации при комнатной температуре [47, 48]. Кроме того, малый размер микроРНК, по сравнению с ДНК и целевыми мРНК, делает их более стабильными и, следовательно, менее подверженными деградации [46].

Несмотря на существование различных вариаций технологии ПЦР, наиболее используемым методом и золотым стандартом остаётся метод количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) благодаря высокой чувствительности, специфичности, доступности и воспроизводимости [38].

Если рассматривать исследования, посвящённые изучению экспрессии микроРНК в контексте аутоиммунной пузырчатки, на сегодняшний день не существует единого подхода к выбору субстратов, протоколов выделения и оценки экспрессии, отсутствует консенсус и в отношении диагностически значимых для заболевания микроРНК (см. табл. 1). Так, например, в исследовании W. He и соавт. [30] на основании изучения экспрессии микроРНК в плазме пациентов с аутоиммунной пузырчаткой выявили повышенную экспрессию 12 микроРНК, при этом чувствительность и специфичность экспрессии miR-584-5p и miR-155-5p для диагностики составила, по данным исследования, 95,5 и 100% соответственно. В рамках исследования установлена также выраженная корреляция между уровнем экспрессии miR-326 и степенью тяжести пузырчатки. При этом в исследовании N. Lin и соавт. [32], в котором основное внимание уделялось miR-338-3p, продемонстрировано, что уровень экспрессии miR-338-3p при аутоиммунной пузырчатке не только был повышен, но и постепенно снижался в процессе эффективной терапии, хотя в исследовании W. He и соавт. [30] miR-338-3p была выведена из эксперимента как микроРНК с низкой экспрессией. В недавнем исследовании A. Valentino и соавт. [28] впервые сообщалось о понижении экспрессии микроРНК при аутоиммунной пузырчатке, в частности miR-148a-3p.

Несмотря на продолжающиеся исследования в различных медицинских областях по поиску роли микроРНК в патологических процессах, в патогенезе многих заболеваний они остаются недостаточно изученными в силу того, что микроРНК является относительно молодой областью науки. Однако выявление микроРНК, специфичных для конкретного заболевания, и учёт их роли в стратегии диагностики, прогноза и лечения открывают всё большие перспективы для современной медицины. Несмотря на то, что при буллёзных дерматозах в целом [49] и при аутоиммунной пузырчатке в частности (см. табл. 1) исследовано большое число микроРНК в различных субстратах, по экспериментальным данным, только miR-338-3p может считаться на сегодняшний день специфичной для данного заболевания.

По современным данным, патогенез аутоиммунной пузырчатки заключается в образовании аутоантител к Dsg3 и/или Dsg1, что приводит к акантолизу кератиноцитов, однако молекулярный механизм, лежащий в основе выработки аутоантител и регуляции гуморального ответа, до конца не определён [2, 50–52]. В исследовании N. Lin и соавт. [32] высказана гипотеза, что дисбаланс Th1/Th2-клеток при аутоиммунной пузырчатке может быть результатом сверхэкспрессии miR-338-3p, которая посредством трансфекции может снижать экспрессию мРНК RNF114, которая в свою очередь, согласно исследованиям, участвует в регуляции апоптоза и активации Т-клеток [53, 54]. При этом взаимодействие miR-338-3p и мРНК RNF114 in vitro было подтверждено с помощью люциферазного репортерного анализа [32]. В другом исследовании [33] выдвинута гипотеза, что ещё одним геном-мишенью для miR-338-3p является TRADD, который также участвует в апоптозе, поскольку в исследованиях как in vitro, так и in vivo уровень мРНК TRADD понижался при сверхэкспрессии miR-338-3p.

Таким образом, miR-338-3p может участвовать непосредственно в патогенезе заболевания, что стало решающим фактором при выборе микроРНК для данного исследования, поскольку в других работах гипотезы участия микроРНК в патогенезе заболевания и влияния на гены-мишени были предсказаны только с помощью компьютерных моделей и баз данных TargetScan, MiRanda MiRTarBase и пр. [28, 30].

Настоящее исследование продемонстрировало значительное отличие уровня экспрессии miR-338-3p в группе пациентов в активной стадии заболевания по сравнению с группой контроля. Уровень экспрессии miR-338-3p коррелировал также с тяжестью заболевания, оценённой по индексу PDAI. Полученные данные не противоречат результатам литературных источников. Так, в исследовании N. Lin и соавт. [32] также установлена повышенная экспрессия miR-338-3p, однако в исследование входили только пациенты с вульгарной пузырчаткой. На основании проведённых литературных поисков можно сделать вывод, что данная работа является первым в русскоязычных источниках исследованием по изучению экспрессии микроРНК при аутоиммунной пузырчатке. Авторским коллективом была разработана технология выделения и оценки уровня экспрессии микроРНК miR-338-3p, при этом протокол (выделение микроРНК, получение кДНК, проведение ПЦР-РВ) основан на использовании реактивов российского производства, что в дальнейшем может сделать его более доступным в клинической практике.

Резюме основного результата исследования

В исследовании установлено, что средний уровень экспрессии miR-338-3p у пациентов в активной стадии заболевания значительно выше, чем в группе контроля, различия между группами статистически значимы (p=0,002). Выявлена корреляция между уровнем экспрессии miR-338-3p и индексом PDAI (p <0,001). Разработана технология выделения и оценки уровня экспрессии miR-338-3p методом ПЦР-РВ.

Ограничения исследования

Ограничением нашего исследования стала малая выборка пациентов, поэтому запланировано более обширное исследование с увеличенной выборкой, чтобы подтвердить предварительные результаты, а также установить референсные интервалы уровня экспрессии miR-338-3p для разработки нового метода диагностики и объективной оценки степени тяжести аутоиммунной пузырчатки. Запланировано также исследование экспрессии miR-338-3p у пациентов в процессе лечения.

Другим ограничением нашего исследования стал выбор одной изучаемой микроРНК. Планируется выявить корреляции уровня экспрессии miR-338-3p с другими ранее исследованными, по данным литературы, микроРНК и лабораторными показателями, поскольку построение дополнительных соотношений может стать основой для создания более точных и специфичных для заболевания моделей, которые в последующем могут быть реализованы в виде системы принятия врачебных решений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аутоиммунная пузырчатка ― группа редких и потенциально смертельных хронических дерматозов. В настоящее время проводится всё больше исследований с целью поиска методов контроля активности заболевания с помощью различных биомаркеров, которые могут быть использованы для мониторинга прогрессирования заболевания и прогноза лекарственного ответа, что позволит оптимизировать выбор персонализированной терапии и избежать тяжёлых осложнений. На основании результатов нашего исследования и сопоставления полученных результатов с данными из различных литературных источников можно сделать вывод о значимости микроРНК в контексте аутоиммунной пузырчатки, а экспрессия miR-338-3p, в частности, может служить ключевым элементом в патогенезе этого заболевания.

Более детальное изучение микроРНК у пациентов с аутоиммунной пузырчаткой, включая большую выборку пациентов и анализ вариабельности экспрессии в зависимости от степени тяжести заболевания и дозировки принимаемых глюкокортикоидов, могут стать основой для создания новых диагностических методов, а также методов объективной оценки степени тяжести заболевания, что позволит применять более точные и менее инвазивные методы диагностики, а также контролировать и прогнозировать течение заболевания.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при подготовке статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Н.П. Теплюк ― концепция исследования, внесение в рукопись существенных правок с целью повышения научной ценности статьи; Д.В. Мак ― сбор и анализ литературных источников, постановка проб ПЦР-РВ на микроРНК, анализ полученных данных, интерпретация результатов, подготовка и написание текста статьи; Ю.В. Колесова ― сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; А.А. Лепехова, Т.А. Федотчева, Д.Н. Ульченко ― редактирование статьи.

Additional information

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. N.P. Teplyuk ― research concept, making significant edits to the manuscript in order to increase the scientific value of the article; D.V. Mak ― collection and processing of materials, setting samples for qRT-PCR for microRNA detection, analysis of the data obtained, results interpretation, writing the manuscript; Yu.V. Kolesova ― collection and processing of materials, analysis of the received data, writing the manuscript; A.A. Lepekhova, T.A. Fedotcheva, D.N. Ulchenko ― editing the article.

About the authors

Natalia P. Teplyuk

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: teplyukn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5800-4800
SPIN-code: 8013-3256

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, 8-2 Trubetskaya street, 119991 Moscow

Daria V. Mak

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: dariamak25@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7020-0572
SPIN-code: 8204-4555
Russian Federation, 8-2 Trubetskaya street, 119991 Moscow

Yuliya V. Kolesova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: kolesovamsmu@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3617-2555
SPIN-code: 1441-8730
Russian Federation, 8-2 Trubetskaya street, 119991 Moscow

Anfisa A. Lepekhova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: anfisa.lepehova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4365-3090
SPIN-code: 3261-3520

MD, Cand. Sci. (Medicine), Associate Professor

Russian Federation, 8-2 Trubetskaya street, 119991 Moscow

Tatiana A. Fedotcheva

The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: tfedotcheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4998-9991
SPIN-code: 1261-5650

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow

Darya N. Ulchenko

The Russian National Research Medical University named after N.I. Pirogov

Email: motci@list.ru
ORCID iD: 0009-0008-1894-5746
SPIN-code: 9735-2364
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files