THE DIAGNOSIS OF DRUG TOXIDERMIA BY THE METHOD OF STIMULATED BARIUM SULFATE LUMINOL-DEPENDENT CHEMILUMINESCENCE OF LEUKOCYTES

Full Text

Лекарственная токсидермия (ЛТ) - острое воспаление кожных покровов и слизистых оболочек, которое развивается под действием лекарственного препарата, попавшего внутрь организма через дыхательную систему, пищеварительный тракт, при инфузионном введении [1, 2]. ЛТ составляет 25% среди побочных эффектов лекарственных средств, являясь огромной проблемой для системы здравоохранения и фармацевтического производства [2]. В настоящее время растёт число лекарственных препаратов, применяемых в лечебной практике; повышается риск развития ЛТ. В связи с этим назрела острая необходимость в разработке методов лабораторной диагностики ЛТ [3, 4]. Лимфоциты, тучные клетки, базофилы, полиморфноядерные лейкоциты (ПМЛ), эозинофилы участвуют в патогенезе ЛТ. ПМЛ принимают участие в качестве клеток-эффекторов в аллергических реакциях; при этом наблюдается изменение как количества ПМЛ в тканях, так и их функциональной активности (способность продуцировать активные формы кислорода (АФК), участвовать в процессе фагоцитоза, ферментативная активность, хемотаксис и др.) [5, 6]. Разработка и применение метода хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови выявили новые возможности для определения повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, в том числе НПВС и антибиотикам, путём оценки секреции АФК ПМЛ [6]. В 1985 г. В.И. Пыцкий и соавт. [6] открыли феномен специфического угнетения аллергеном стимулированной сульфатом бария люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов (СЛХЛ) периферической крови сенсибилизированных людей и разработали тест для выявления сенсибилизации к пыльцевым, лекарственным (пенициллин) и другим аллергенам. В дальнейшем было обнаружено изменение СЛХЛ при псевдоаллергии и создан тест in vitro для выявления непереносимости аспирина и анальгина. Назрела необходимость подобрать метод СЛХЛ для диагностики ЛТ с другими препаратами группы НПВС и антибиотиков и на основе него создать эффективный метод для определения гиперчувствительности на лекарственные средства in vitro у больных ЛТ и для диагностики аллергической реакции на конкретный лекарственный препарат. Кроме того, важно разработать метод персонифицированного подбора заместительной терапии. В ходе ретроспективного анализа 100 историй болезней пациентов с ЛТ за период с 2012 по 2016 г., проведённого в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, было определено, что наиболее часто заболевание развивалось при приёме лекарственных препаратов группы НПВС - у 39% - и антибиотиков - у 22% (p < 0,01). Среди лекарственных препаратов группы НПВС развитие ЛТ в наибольшей степени было вызвано приёмом ибупрофена - 23,9%, нимесулида - 23,9% и парацетамола - 23,9% случаев (p ≤ 0,003); среди лекарственных препаратов группы антибиотиков - приёмом амоксициллина (22,7%) и цефтриаксона (22,7%) (p < 0,01) [7]. Учитывая высокую долю случаев ЛТ, вызванных приёмом ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона, было необходимо опробовать метод СЛХЛ у пациентов с непереносимостью данных препаратов. Цель работы - определить влияние ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона на СЛХЛ цельной крови у больных ЛТ, возникшей после приёма данных лекарственных препаратов, и участников контрольной группы для подбора препаратов с целью заместительной терапии. Материал и методы В исследование включили 67 пациентов (44 женщины и 23 мужчины) с ЛТ в возрасте от 18 до 75 лет (медиана возраста 53 года), из них ЛТ развилась после приёма ибупрофена у 22,4%, парацетамола - у 20,9%, нимесулида - у 19,4%, амоксициллина - у 20,9%, цефтриаксона - у 16,4% (рис. 1). Все больные проходили лечение в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет). Критерии включения пациентов в исследование: развитие кожной реакции после приёма вышеуказанных лекарственных препаратов. Критерии невключения: состояние алкогольного или наркотического опьянения у пациента, невозможность забора венозной крови у пациента, приём антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, кромоглициевой кислоты, системных глюкокортикостероидов за 2 нед и менее до исследования. Контрольная группа состояла из 67 человек (42 женщины и 25 мужчин) в том же возрастном диапазоне, ранее принимавших данные лекарственные препараты без проявления ЛТ. Измерение СЛХЛ проводили на хемилюминометре Lum-100, разработанном на кафедре медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ Excel 2010 и Statistica 7.0 с использованием критериев Фишера, Манна-Уитни и Стьюдента. Полученные результаты представлены в виде M ± m (М - среднее арифметическое, m - ошибка среднего). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Для исследования использовали гепаринизированную венозную кровь (50 ЕД/мл). Из образцов крови отбирали объёмы, содержащие 1 × 106 лейкоцитов, и доводили до 0,70 мл средой Хенкса. Пробы инкубировали в течение 45 мин при температуре 37 °С при постоянном перемешивании. В кювету хемилюминометра вносили 0,70 мл пробы и 0,15 мл активатора свечения - люминола (“Sigma-Aldrich”, США) с концентрацией 2 мМ. Далее измеряли уровень спонтанной хемилюминесценции (ХЛ). Затем к полученным образцам добавляли 0,15 мл активатора свечения - сульфата бария («ВИПС-МЕД», Россия) в концентрации 2 мг/мл, после чего измеряли уровень стимулированной ХЛ. Регистрацию кинетики стимулированной ХЛ проводили в течение 50 мин при температуре 37 °С. Для определения влияния аллергена (лекарственного препарата, вызвавшего реакцию) на СЛХЛ к полученным пробам добавляли 0,01 мл лекарственного препарата, растворённого в воде для инъекций. Для подбора препаратов для заместительной терапии к пробам крови добавляли 0,01 мл раствора выбранного препарата. В контрольные пробы вместо исследуемого аллергена или препарата для заместительной терапии добавляли воду для инъекций в том же объёме. Далее проводили регистрацию СЛХЛ. С помощью программы PowerGraph определяли следующие параметры СЛХЛ (рис. 2): •интенсивность спонтанной ХЛ; •интенсивность максимальной ХЛ; •интенсивность стимулированной ХЛ (разница между максимальной и спонтанной ХЛ); •относительная интенсивность ХЛ (отношение интенсивности стимулированной ХЛ в опыте к интенсивности стимулированной ХЛ в контроле); •светосумма (площадь под кривой ХЛ, начиная от введения сульфата бария и до окончания кинетики). Результаты В первой серии экспериментов проведено исследование влияния ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона на интенсивность и светосумму СЛХЛ крови участников контрольной группы и больных ЛТ. Была выявлена статистически значимая зависимость между изменением относительной интенсивности СЛХЛ и концентрацией препаратов в обеих группах испытуемых. В контрольной группе отмечено, что минимальные концентрации лекарственных препаратов (как группы НПВС - ибупрофен, нимесулид, парацетамол, так и антибиотиков - амоксициллин, цефтриаксон) стимулировали СЛХЛ крови, а максимальная концентрация подавляла СЛХЛ. У пациентов с ЛТ стимуляция СЛХЛ не наблюдалась, а ингибирование СЛХЛ происходило при применении препаратов в меньших концентрациях, чем в контрольной группе. На всех исследованных нами концентрациях лекарственных препаратов относительная интенсивность СЛХЛ у больных была значимо ниже, чем у участников группы контроля (табл. 1, 2). Следовательно, можно сделать вывод, что ибупрофен, нимесулид, парацетамол, амоксициллин, цефтриаксон дозозависимо влияют на СЛХЛ цельной крови как в контрольной группе, так и у больных с непереносимостью данных лекарственных препаратов. Активация СЛХЛ в контрольной группе при инкубации проб крови с малыми концентрациями препаратов может быть обусловлена стимулирующим влиянием на выработку АФК фагоцитами продуктов липооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты (эйкозатетраеновых метаболитов, лейкотриена В4), образующихся в лейкоцитах под влиянием лекарственных препаратов [3, 8, 9]. Эйкозатетраеновые метаболиты, являющиеся оксидантами, могут напрямую взаимодействовать с люминолом, усиливая ХЛ фагоцитов [3, 10, 11]. Ингибирующее действие высоких концентраций лекарственных препаратов на СЛХЛ крови участников контрольной группы может быть вызвано уменьшением активности простагландинсинтазы, снижением синтеза эйкозатетраеновых метаболитов в лейкоцитах периферической крови, усилением его антиокислительной активности [3, 12, 13]. Подавление СЛХЛ крови пациентов с ЛТ, возможно, происходит за счёт влияния на системы медиаторов аллергических и воспалительных реакций: лейкотриенов, гистамина и серотонина [3, 14, 15]. Показатели светосуммы у пациентов с ЛТ были значимо ниже, чем у участников контрольной группы. Данные результаты могут свидетельствовать о снижении суммарной продукции АФК ПМЛ у больных (табл. 3, 4). В следующей серии опытов проводили подбор лекарственных препаратов для заместительной терапии у пациентов с ЛТ (табл. 5, 6). В результате исследования было выявлено, что при инкубации образцов крови пациентов с минимальными концентрациями ЛПТ и ЛПЗ существенных различий показателей относительной интенсивности и светосуммы СЛХЛ нет (p > 0,05). Однако в пробах крови с максимальной концентрацией ЛПТ показатели СЛХЛ значительно ниже, чем в пробах с максимальной концентрацией ЛПЗ (p < 0,01). Полученные результаты доказывают, что метод СЛХЛ подходит как для диагностирования ЛТ, вызванной приёмом ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона, так и для персонифицированного подбора лекарственного препарата с целью заместительной терапии. Выводы • При воздействии ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона на кровь больных с непереносимостью данных препаратов и контрольной группы наблюдается концентрационнозависимое изменение СЛХЛ. Относительная интенсивность и светосумма СЛХЛ крови у больных достоверно ниже таковой у контрольной группы на всех исследованных концентрациях препарата (p < 0,01). • При максимальной концентрации относительная интенсивность и светосумма СЛХЛ крови у больных достоверно ниже в пробах с ЛПТ, чем с ЛПЗ (p < 0,01) При минимальной концентрации значительные отличия показателей отсутствуют (p > 0,05). • Выявленные достоверные различия показателей СЛХЛ позволяют применить хемилюминесцентный метод для диагностики непереносимости ибупрофена, парацетамола, нимесулида, амоксициллина, цефтриаксона и для персонифицированного подбора препаратов для заместительной терапии.

About the authors

N. P Teplyuk

Department of Dermatology and Venereology, I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Moscow, 119435, Russian Federation

N. L Shimanovskiy

Department of Molecular Pharmacology and Radiobiology of Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, 119435, Russian Federation

A. V Semeykin

Department of Molecular Pharmacology and Radiobiology of Pirogov Russian National Research Medical University

Moscow, 119435, Russian Federation

Zilola S. Kadyrova

Department of Dermatology and Venereology, I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: rose1604@yandex.ru
postgraduate of Department of Dermatology and Venereology of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, 119991, Russian Federation Moscow, 119435, Russian Federation

References

Supplementary files