DIAGNOSING OF DRUG TOXIDERMIA CAUSED BY NUROFEN BY THE METHOD OF BARIUM SULFATE STIMULATED LUMINOL-DEPENDENT CHEMILUMINESCENCE OF LEUKOCYTES

Full Text

В связи с расширением фармацевтического рынка побочное действие лекарственных средств (ПДЛС) становится актуальнейшей проблемой клинической медицины [1]. Частота встречаемости ПДЛС колеблется от 18 до 44% [2, 3]. По определению ВОЗ (2010 г.), ПДЛС - это непреднамеренная и вредная реакция организма, наблюдаемая у человека при использовании лекарственного препарата (ЛП) в обычных дозах в целях профилактики, диагностики или лечения заболевания [4]. Лекарственной токсидермией (ЛТ) называют острое воспаление кожного покрова и слизистых оболочек, развивающееся под действием ЛП, попавшего внутрь организма через дыхательную систему, пищеварительный тракт, при инфузионном введении [5]. ЛТ составляет 25% среди ПДЛС, являясь огромной проблемой для системы здравоохранения и фармацевтического производства [5]. С увеличением количества лекарственных средств (ЛС), применяемых в лечебной практике, повышается риск развития ЛТ. В связи с этим имеется острая необходимость в лабораторно-диагностических методиках [6]. Методы диагностики ЛТ На данный момент известно несколько диагностических методов, позволяющих установить ЛП, вызвавший развитие ЛТ: •Тест торможения естественной эмиграции лейкоцитов по А.D. Адо для диагностики аллергии на антибиотики, сульфаниламиды, местные анестетики, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). •Кожное тестирование. Высокая чувствительность и диагностическая значимость показаны при аллергических реакциях немедленного типа с ограниченной группой ЛС, таких как β-лактамные антибиотики, мышечные релаксанты, соли платины и гепарины. Но при тестировании с большинством других ЛС информативность кожного тестирования умеренная или низкая. Другими недостатками метода являются: опасность развития жизнеугрожающих состояний при проведении тестирования, наличие стандартизированных аллергенов для диагностики ЛТ на ограниченную группу препаратов (в России не зарегистрированы), возможность ложноположительных (из-за местного раздражающего действия ЛП на кожу) и ложноотрицательных результатов. •Провокационные дозируемые тесты (ПДТ) с введением препарата в полной терапевтической дозе являются золотым стандартом для выявления причинно-значимого ЛС. Проводятся в условиях стационара с отделением реанимации при невозможности замены ЛС альтернативным. •Определение антиген-специфических сывороточных IgE-антител. Осуществляется при аллергических реакциях немедленного типа для β-лактамных антибиотиков, мышечных релаксантов, инсулина, химопапаина и пр. Отсутствие циркулирующих IgE к ЛС не исключает наличие ЛТ. •Реакция бласттрансформации лимфоцитов или тест трансформации лимфоцитов с определением маркёров ранней и поздней активации - при аллергических реакциях замедленного типа для β-лактамных антибиотиков, хинолонов, сульфаниламидов, противоэпилептических препаратов, местных анестетиков и пр. •Тесты активации базофилов (Cellular allergen stimulation test - CAST, flow-cytometric allergen stimulation test - FAST, Flow CAST) - при аллергических реакциях немедленного типа и псевдоаллергии для β-лактамных антибиотиков, НПВС, мышечных релаксантов и пр. [7]. Важно отметить, что вышеперечисленные тесты могут давать как ложноположительные результаты, так и ложноотрицательные [7]. Ввиду вышесказанного ведётся поиск новых тестов для диагностики ЛТ и выявления ЛС, которое вызвало её развитие. Лимфоциты, тучные клетки, базофилы, полиморфно-ядерные лейкоциты (ПМЛ), эозинофилы участвуют в патогенезе ЛТ. ПМЛ принимают участие в аллергических реакциях в качестве клеток-эффекторов, при этом наблюдается их количественное изменение в тканях, изменение их функциональной активности (способность продуцировать активные формы кислорода - АФК, способность участвовать в процессе фагоцитоза, ферментативная активность, хемотаксис и др.) [8, 9]. Разработка и применение метода хемилюминесценции (ХЛ) лейкоцитов периферической крови выявили новые возможности для определения повышенной чувствительности к ЛП, в том числе НПВС, путём оценки секреции АФК ПМЛ [9]. В 1985 г. Пыцкий В.И. и соавт. [9] открыли феномен специфического угнетения аллергеном стимулированной сульфатом бария люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов (СЛХЛ) периферической крови сенсибилизированных людей, на основании чего разработали тест для выявления сенсибилизации к пыльцевым, лекарственным (пенициллин) и другим аллергенам. Впоследствии было обнаружено изменение СЛХЛ при псевдоаллергии и создан тест in vitro для выявления непереносимости аспирина и анальгина. В дальнейшем метод СЛХЛ был успешно испытан у пациентов с бронхиальной астмой или отёком Квинке с непереносимостью НПВС. Было отмечено, что при добавлении салицилата натрия или метамизола натрия к пробам крови пациентов с непереносимостью ацетилсалициловой кислоты и/или метамизола натрия наблюдалось ингибирование СЛХЛ. У здоровых доноров показатели СЛХЛ под воздействием этих НПВС были выше, чем у анализируемых больных [9]. Перспективным является исследование метода СЛХЛ для диагностики ЛТ с другими препаратами группы НПВС и создание эффективного метода для определения гиперчувствительности на ЛС in vitro и персонифицированного подбора патогенетической терапии у больных ЛТ с целью профилактики развития заболевания. В ходе ретроспективного анализа историй болезней пациентов с ЛТ в период с 2012 по 2016 гг., проведённого нами в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, было определено, что наиболее часто заболевание развивалось при приёме ЛП группы НПВС - у 39% и антибиотиков - у 22% (р < 0,01). Среди ЛП группы НПВС развитие ЛТ статистически значимо выше было вызвано приёмом нурофена - у 23,9%, найза - у 23,9% и парацетамола - у 23,9% (p ≤ 0,003) [10]. Учитывая высокую долю случаев ЛТ, вызванных приёмом нурофена (ибупрофена), целесообразно опробовать метод СЛХЛ у пациентов с непереносимостью данного препарата. Цель исследования - определить общие закономерности изменения СЛХЛ крови под влиянием нурофена у больных ЛТ, возникшей после приёма данного ЛП, и здоровых доноров, а также подобрать препараты из группы НПВС с целью заместительной терапии. Материал и методы Были проанализированы 15 пациентов (11 женщин и 4 мужчин) в возрасте от 18 до 75 лет (медиана 53 года) с ЛТ, развившейся после приёма нурофена (ибупрофена), - из них 7 больных токсидермией, 4 больных острой крапивницей. Все больные проходили лечение в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова. Критерии включения пациентов в исследование: появление кожной реакции после приёма нурофена (ибупрофена) в любой лекарственной форме. Критерии невключения: приём антигистаминных, антисеротониновых, антилейкотриеновых препаратов, кромоглициевой кислоты, системных глюкокортикостероидов з а 2 нед и менее до исследования. Контрольная группа состояла из 15 человек (9 женщин и 6 мужчин) в том же возрастном диапазоне. Критерии включения: отсутствие побочных эффектов после приёма нурофена (ибупрофена) в любой лекарственной форме. Критерии невключения: приём антигистаминных препаратов, НПВС в ближайшие 2 нед до эксперимента. Измерение СЛХЛ проводили на хемилюминометре Lum-100, разработанном на кафедре медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова. Для исследования использовали гепаринизированную венозную кровь (50 ЕД/мл). Из образцов крови отбирали объёмы, содержащие 1 × 106 лейкоцитов, и доводили их до 0,7 мл средой Хенкса. Пробы инкубировали в течение 45 мин при температуре 37°С при постоянном перемешивании. В кювету хемилюминометра вносили 0,70 мл пробы и 0,15 мл активатора свечения - люминола (Sigma-Aldrich, США) с концентрацией 2 мМ. Далее измеряли показатели спонтанной хемилюминесценции. Затем к полученным образцам добавляли 0,15 мл активатора свечения - сульфата бария (ООО «Фирма ВИПС-МЕД», Россия) в концентрации 2 мг/мл и измеряли показатели стимулированной ХЛ. Регистрацию кинетики стимулированной хемилюминесценции проводили в течение 50 мин при температуре 37°С. Для определения влияния аллергена (ЛП, вызвавшего реакцию) на СЛХЛ к полученным пробам добавляли 0,01 мл растворённого в воде для инъекций ибупрофена (ЗАО «Медисорб», Россия). Для подбора препаратов для заместительной терапии к пробам крови добавляли 0,01 мл раствора парацетамола (ООО «Фармлэнд», Россия) или 0,01 мл растворённого в воде для инъекций нимесулида («Изварино Фарма», Россия). В контрольные пробы вместо исследуемого аллергена или препарата для заместительной терапии добавляли воду для инъекций в том же объёме. Далее проводили регистрацию СЛХЛ. С помощью программы PowerGraph определяли следующие параметры СЛХЛ: интенсивность спонтанной ХЛ; интенсивность максимальной ХЛ; интенсивность стимулированной ХЛ, равной разнице между максимальной и спонтанной ХЛ; светосумма (площадь под кривой ХЛ, начиная от введения сульфата бария и до окончания кинетики). При оценке влияния нурофена на ХЛ крови определяли относительную интенсивность ХЛ, которую рассчитывали как отношение интенсивности стимулированной ХЛ в опыте к интенсивности стимулированной ХЛ в контроле, и относительную светосумму (отношение светосуммы стимулированной ХЛ в опыте и светосуммы стимулированной ХЛ в контроле) (см. рисунок). Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ Excel 2010 и Statistica 7.0 с использованием критериев Фишера и Манна-Уитни. Полученные результаты представлены в виде M ± m, где М - среднее арифметическое, m - ошибка среднего. Результаты и обсуждение В первой серии экспериментов проводили исследование влияния нурофена (ибупрофена) на интенсивность и светосумму СЛХЛ крови участников контрольной группы и больных ЛТ. Была выявлена статистически значимая зависимость между изменением относительной интенсивности СЛХЛ и концентрацией нурофена в обеих группах обследуемых. В контрольной группе было отмечено, что малые концентрации ЛП (109,2 мкМ, 218,4 мкМ) стимулировали СЛХЛ крови, а большая концентрация (655,2 мкМ) подавляла СЛХЛ. У пациентов с ЛТ стимуляция СЛХЛ не наблюдалась, а ингибирование СЛХЛ происходило при применении нурофена в меньших концентрациях (327,6 мкМ, 655,2 мкМ), чем в контрольной группе. На всех исследованных нами концентрациях препарата относительная интенсивность СЛХЛ у больных была статистически значимо ниже, чем у контрольной группы (табл. 1). Следовательно, можно сделать вывод о том, что нурофен (ибупрофен) дозозависимо влияет на СЛХЛ цельной крови как в контрольной группе, так и у пациентов с непереносимостью данного ЛС. Активация СЛХЛ в контрольной группе при инкубации проб крови с малыми концентрациями нурофена (ибупрофена) может быть обусловлена стимулирующим влиянием на выработку АФК фагоцитами продуктов липооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты (эйкозатетраеновых метаболитов, лейкотриена В4), образующихся в лейкоцитах под влиянием ЛП [6, 11]. В то же время эйкозатетраеновые метаболиты, являясь оксидантами, могут напрямую взаимодействовать с люминолом, усиливая ХЛ фагоцитов [6, 12]. Подавляющее действие высоких концентраций нурофена (ибупрофена) на СЛХЛ крови участников контрольной группы может быть вызвано ингибированием активности фосфолипазы А2, снижением синтеза эйкозатетраеновых метаболитов в лейкоцитах периферической крови, усилением его антиокислительной активности, в частности способности ингибировать процессы образования супероксид-анионов в активированных фагоцитах [6, 13]. Феномен подавления СЛХЛ крови пациентов с ЛТ может быть опосредован влиянием на системы медиаторов аллергических и воспалительных реакций: лейкотриенов, гистамина и серотонина [6, 14]. Показатели относительной светосуммы у больных ЛТ были ниже, чем у участников контрольной группы. Данные результаты свидетельствуют о снижении суммарной продукции АФК ПМЛ у пациентов (табл. 2). Важно отметить, что статистически значимых различий между показателями относительной интенсивности и относительной светосуммы у больных токсидермией и у больных острой крапивницей не выявлено (p > 0,05) (табл. 3, 4). В следующей серии опытов проводили подбор ЛС из группы НПВС с целью заместительной терапии у пациентов с ЛТ. Для анализа мы выбрали препараты найз (нимесулид) и парацетамол, учитывая их широкое применение в клинической медицине. В ходе исследования было выяснено, что при инкубации образцов крови пациентов с минимальными концентрациями нурофена (ибупрофена) и парацетамола существенных различий показателей относительной интенсивности и относительной светосуммы СЛХЛ нет (р > 0,05). В то же время в пробах крови с максимальной концентрацией нурофена (ибупрофена) наблюдалось значительно более сильное ингибирование СЛХЛ - 66%, чем в пробах с максимальной концентрацией парацетамола - 25% (p < 0,01). Показатели относительной светосуммы также были ниже в образцах крови с нурофеном (ибупрофеном), чем в образцах с парацетамолом (p < 0,01) (табл. 5, 6). Аналогичные результаты были получены в серии экспериментов с образцами крови, инкубированными с нурофеном (ибупрофеном) и найзом (нимесулид) (табл. 7, 8). Таким образом, можно сделать вывод, что метод СЛХЛ подходит как для диагностирования ЛТ, вызванной приёмом нурофена (ибупрофена), так и для персонифицированного подбора ЛП для заместительной терапии. Выводы 1. При воздействии нурофена (ибупрофена) на кровь больных с непереносимостью данного препарата и контрольной группы происходит дозозависимое изменение СЛХЛ. Относительная интенсивность и относительная светосумма СЛХЛ крови у больных статистически значимо ниже таковой у контрольной группы на всех исследованных концентрациях препарата. 2. Показатели СЛХЛ при различных формах ЛТ статистически значимо не различаются (p < 0,01). 3. Относительная интенсивность и относительная светосумма СЛХЛ крови у больных значимо ниже в пробах с ЛП, вызвавшим развитие заболевания, чем с препаратами для заместительной терапии. При минимальной концентрации значительные различия показателей отсутствуют (p > 0,05). 4. Выявленные статистически значимые различия показателей СЛХЛ позволяют применить хемилюминесцентный метод для диагностики непереносимости нурофена (ибупрофена) и для персонифицированного подбора препаратов для заместительной терапии.

About the authors

N. P Teplyuk

Department of skin and venereal diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

119435, Moscow, Russian Federation

Zilola S. Kadyrova

Department of skin and venereal diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: rose1604@yandex.ru
postgraduate of the Department of skin and venereal diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 119435, Moscow, Russian Federation 119435, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files