Angiogenesis features in patients with melanoma with different BRAf status

Full Text

Неонгиогенез имеет большое значение в развитии и прогрессии опухолевого процесса [1]. Данный факт доказывается экспериментальными исследованиями, в которых регресс опухоли достигается не только индукцией апоптоза, но и угнетением опухолевого ангиогенеза посредством подавления проангиогенных молекул, таких как гипоксия-индуцибельный фактор альфа 1 (HIFa1), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интерлейкин-8 (IL-8) и трансформирующий ростовой фактор бета 1 (TGFP1) [2]. Мутация гена BRAF определяется в 40-60% меланом, преобладая среди опухолей, расположенных на закрытых участках тела. Наличие данной мутации лежит в основе классификации меланомы по молекулярным подтипам. При этом известно, что в ткани больных раком щитовидной железы увеличен как интратумораль- ный, так и перитуморальный ангиогенез [3]. Опухолевый ангиогенез представляет собой важный этап в формировании и дальнейшем распространении опухоли любого гистогенеза. Показано, что BRAF-ингибитор вемурафениб, помимо направленного действия на компоненты сигнального пути митоген- активируемых протеинкиназ, вызывает снижение синтеза таких ангиогенных факторов как фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), VEGF-C, а также IL-6 (интерлейкин-6) в опухолевых клетках при раке щитовидной железы [4]. Для оценки васкуляризации в опухоли широко используют определение экспрессии белка CD31. Антитела к данному белку избирательно связываются с CD31-гликопротеином с молекулярной массой 130 кД в эндотелии сосудов, позволяя оценить степень васкуляризации и плотность сосудистого русла ткани [5]. Одним из ангиогенных факторов является ма- триксная металлопротеиназа-9, фермент семейства эндопептидаз, принимающий участие в деградации межклеточного матрикса и ремоделировании сосудов [6]. Протеолитическое действие матриксной металло- протеиназы-9 (ММП-9) главным образом регулирует биодоступность сосудистого эндотелиального фактора роста - VEGF и фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), которые находятся во внеклеточном матриксе, как правило, в неактивной форме. Описана роль ММП-9 в миграции клеток [7], что также способствует неоангиогенезу. Цель данного исследования - изучение плотности микроциркуляторного русла в опухоли и пе- ритуморальной зоне у больных меланомой кожи, имеющих различный BRAF-статус, путем подсчета CD31-положительно окрашенных клеток, а также определение экспрессии ММП-9 в опухоли и клетках микроокружения с последующим анализом наличия взаимосвязи между данными показателями. Материал и методы Объектом данного исследования послужили образцы опухолевого материала, полученные из парафиновых блоков от больных меланомой кожи, проходивших лечение в КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Био- птаты больных меланомой кожи (п = 57) получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и проводили дальнейшую морфологическую оценку. Перед выделением ДНК стекла с окрашенными гематоксилином и эозином препаратами, оценивали на наличие опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit (ООО «Биолинк», РФ). Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для BRAF-теста выбирали разведение клинического образца ДНК, имеющее значение Ct наиболее близкое к отрицательному ДНК-стандарту: оптимальным считается чтобы, Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалось от Ct ДНК контроля не более, чем на 2 цикла. Образец ДНК расценивали как положительный (т.е. содержащий мутацию), если dCt образца не более dCt положительного контроля, содержащего 5% мутантной ДНК. Образец ДНК считали отрицательным (нет мутации или мутировано менее 1% ДНК-копий гена BRAF), если dCt- образец более dCtm, где Ctm - Ct положительного стандарта (контроля), содержащего 5% ДНК с мутацией BRAF V600E. Далее пациенты были разделены на две группы в соответствии с молекулярно-генетическими подтипами опухоли: Рис. 1. СD31+-клетки эндотелия сосудов, субэпидермальной и интраопухолевой локализации. Ув. 100. 1-я группа - пациенты, имеющие мутацию BRAF V600E (п = 27), 2-я группа - пациенты, не имеющие мутации BRAF V600E (п = 30). Материал подвергали иммуногистохимиче- скому окрашиванию по стандартной методике с применением моноклональных антител к CD31 (JC70) (“Cell Marcue”, США), разведение 1:100. Для доокраски ядер использовали гематоксилин Майера. Подсчет сосудов в опухоли и в перитуморальной зоне проводили путем подсчета CD31-положительно окрашенных сосудов в абсолютных числах, при увеличении 200 (оценивали не менее трех репрезентативных полей зрения, сверху вниз, слева направо, а затем рассчитывали средний показатель). Визуализацию проводили с помощью микроскопа Olympus BX-41 с видеонасадкой Olympus U-CMAD3 и программного обеспечения Infinity Capture. Для определения экспрессии ММП-9 образцы опухолевой ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуно- гистохимическому окрашиванию по стандартной методике с применением поликлональных антител к ММП-9 (“Abeam”, Великобритания), разведение 1:100. Для визуализации Рис. 2. СD31+-клетки эндотелия сосудов, субэпидермальной и интраопухолевой локализации. Ув. 200. Таблица 1 Выраженность васкуляризации у больных различными клинико-морфологическими формами меланомы кожи в зависимости от BRAF-статуса Вид меланомы BRAF + BRAF р Поверхностно распространяющаяся меланома 8,9 9,0 0,99 Узловая меланома 8,6 6,7 0,36 Лентиго меланома 12,3 6,6 0,12 использовали систему детекции Reveal Biotin Free. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Подсчет положительно окрашенных клеток производили при ув. 400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 7,0. Проверку нормальности распределения выборки проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Учитывая ненормальный характер распределения в данной выборке, был использован непараметрический критерий Манна-Уитни. Для оценки факта наличия корреляционных связей их силы и направленности был использован коэффициент корреляции Спирмена. При р < 0,05 различия считали статистически значимыми. Результаты При проведении сравнительного исследования экспрессии CD31 у больных с различным BRAF- статусом выявлено, что среднее число положительно окрашенных сосудов в опухоли у больных с BRAF- положительным статусом 9,74 ± 5,07, а отрицательным - 7,74 ± 5,35. В препаратах обнаруживали в основном сосуды малого и среднего диаметра, которые локализовались вокруг опухоли преимущественно в субэпидермальной зоне (рис. 1), наблюдалась также интратуморальная локализация сосудов (рис. 2). Экспрессия CD31 в опухоли BRAF-положительных больных была несколько ниже по сравнению с пери- туморальной зоной и составила 8,44 ± 5,35, а среднее количество сосудов - 11,55 ± 6,02, данные различия статистически незначимые (р > 0,05). Мы не обнаружили взаимосвязи между возрастом больных и экспрессией CD31 в сосудах опухолевой ткани, а также в ткани микроокружения как при BRAF-положительной (г = -0,23; р > 0,05), так и при BRAF-отрицательной меланоме (г = -0,14; р > 0,05). При этом выявлена зависимость между степенью васкуляризации ткани у пациентов с различным BRAF-статусом и полом больного. Так, у больных мужского пола с меланомой кожи, не имеющих BRAF V600E мутации, имеется положительная корреляционная связь между количеством сосудов в опухоли и перитуморальной зоне (г = 0,87; р > 0,05), в то время как у BRAF-положительных больных корреляционная связь между количеством сосудов в опухоли и пери- туморальной зоне и полом была слабой и составила (г = 0,119; р < 0,05). При сравнении количества сосудов, экспрессирующих СD31 в разных клинико-гистологических подтипах меланомы, а именно в поверхностно-рас- пространяющейся, узловой и лентиго меланоме, не выявлено статистических различий, как в BRAF- положительных, так и в BRAF-отрицательных опухолях (табл. 1). При BRAF- положительной ленти- Таблица 2 Выраженность васкуляризации у больных меланомой кожи различной локализации в зависимости от BRAF-статуса Локализация BRAF + BRAF р Голова, шея 7,1 13,2 0,53 Туловище 10,4 6,0 0,04 Верхние конечности 13,3 10,1 0,49 Нижние конечности 7,7 8,9 0,57 го-меланоме наблюдалась тенденция к увеличению васкуляризации в 2 раза по сравнению с BRAF- отрицательной. Выявлено изменение уровня васку- ляризации в зависимости от локализации первичной опухоли, который был статистически выше у BRAF- положительных больных с локализацией опухоли на коже туловища (р < 0,05; табл. 2). Но при этом не выявлено значимых различий по другим важным морфологическим показателям, таким как изъязвление опухоли, выраженность лимфоцитарной инфильтрации и толщина опухоли (р > 0,05). По данным литературы [8], васкуляризация опухоли в центре и на периферии новообразования не одинакова. Показано, что васкуляризация в перитуморальной области выше, чем в самой опухоли, при этом интраопу- холевая васкуляризация выше в BRAF-положительных опухолях [9]. Кроме того в эксперименте было показано, что при меланоме кожи все интратуморальные сосуды пытаются внедряться в глубину опухоли и после прекращения интравазации, при этом пролиферация эндотелиальных клеток сосудов прекращается и сосуды продолжают расти только в ширину [10]. В проведенном исследовании не выявлено статистически значимых различий в экспрессии ММП-9 в зависимости от BRAF-статуса, как в опухоле- Таблица 3 Экспрессия ММП-9 в опухоли и клетках перитуморальной зоны Экспрессия ММП-9 при меланоме MMP-9, ИГХ-коэффициент с различным BRAF-статусом опухоль клетки стромы Меланома (мутация BRAF V600E) 28,67 ± 45,10 35,22 ± 30,0 Меланома (BRAF, дикий тип) 34,61 ± 38,27 44,22 ± 16,03 вых клетках, так и в клетках окружающей стромы (р > 0,05). Выявлена тенденция к увеличению экспрессии ММП-9 в клетках окружающей стромы: в фибробластах, лимфоцитах, эндотелиальных клетках, полиморфно-ядерных лейкоцитах, независимо от BRAF-статуса (табл. 3). В опухолевых комплексах ММП-9 определялась диффузно, как в эпидермисе, так и в клетках дермы. При анализе экспрессии ММП-9 иммуногистохимический коэффициент варьировал от 1 до 205. Не выявлено значимых различий между исследуемыми маркерами и BRAF-статусом пациентов. Помимо опухолевых клеток, было выявлено наличие экспрессии и лимфоцитами опухоли, при этом не выявлено корреляционной взаимосвязи между данным показателем и BRAF-статусом опухоли (r = 0,34). Обсуждение Формирование сосудов в опухоли является сложным и последовательным процессом, который зависит от баланса между стимулирующими и ингибирующими ангиогенез факторами, включающими в себя ремоделирование межклеточного матрикса, миграцию клеток и процессы регулируемой межклеточной адгезии между клетками сосудистого эндотелия и компонентами межклеточного матрикса. ММП-9 Проангиогенная роль VEGF Антиангиогенная роль Тум стати н Ангиостатин Эндостатин Рис. 3. Влияние ММП-9 на ангиогенез при меланоме кожи. ММП-9 оказывает разнонаправленный эффект на ангиогенез в опухоли. ММП-9 может ингибировать ангиогенез за счет экспрессии ангиостатических факторов, таких как тумстатин, ангиостатин, эндостатин. В свою очередь ММП-9 может усиливать неоангиогенез в опухоли за счет активации VEGF в межклеточном матриксе опухоли. Гипоксия v Стромальная/опухолевая ММП-9 X I Ангиогенные факторы и другие факторы роста & *. и** «9 Воспаление ' ' > Ь АНГИОГЕНЕЗ •л- / Л 3U А пмя«* *• лейкоц >_ • -X ^ '.V Свободные & ТИМП _ Рис. 4. Активация ангиогенеза в опухоли под влиянием ММП-9, вызванная опухоль-ассоциированой гипоксией ткани. ПМЯ лейкоц. - полиморфноядерные лейкоциты; ТИМП - тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ. Процесс ангиогенеза при меланоме можно разделить на несколько стадий аналогичные тем, которые сопровождают опухолевую инвазию: • процесс пролиферации эндотелиальных клеток; • деструкция компонентов межклеточного матрикса; • миграция эндотелиальных клеток [11]. ММП традиционно считаются проангиогенны- ми агентами, при этом ММП способны проявлять и антиангиогенные свойства. Так, ММП-9 наряду с ММП-3, ММП-7, ММП-12 гидролизуют плазминоген до ангиостатина, тем самым оказывая выраженное ингибирующее влияние на ангиогенез [12]. В целом, ММП-9 может оказывать как ангиогенное, так и про- ангиогенное действие на опухолевый рост. Схематично ангиогенная и проангиогенная роль ММП-9 представлена на рис. 3. В отличие от нормальных кровеносных сосудов, внутриопухолевые сосуды являются незрелыми структурами, развитие которых сопряжено с процессом воспаления [13], при этом в очаге воспаления наблюдается скопление большого количества полиморфноядерных лейкоцитов, которые в свою очередь являются источником ММП-9 в опухолевом узле. Последняя, экспрессируясь данными клетками, регулирует пролиферацию перицитов и стимулирует ангиогенные импульсы для выделения факторов роста из красного костного мозга [14]. Воспаление в перитуморальной зоне способствует индукции процесса неоангиогенеза, за счет гиперпродукции провоспалительных цитокинов: TNFa, IL-17 и IL-18, которые способствуют экспрессии MMП-9, гиперэкспрессия которой, стимулирует миграцию перицитов и гладкомышечных клеток сосудов во время ангиогенеза [15]. Гиперэкспрессия ММП-9 как опухолевыми, так и клетками стромального микроокружения опухоли способствует высвобождению ангиогенных ростковых факторов, таких как VEGF и FGF из матриц. Подобные взаимодействия приводят не только к поддержанию опухолевого неоангиогенеза, но и способствуют гиперакивации гемопоэза [16], что также способствует прогрессии опухоли через увеличение миелоидных супрессорных клеток, которые подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов и тем самым активируют у опухоли способность уклоняться от иммунного надзора. Помимо этого ММП-9 способствует увеличению в опухолевой ткани проангиогенных моноцитов и СИ34+-клеток-предшественников эндотелиальных клеток, которые экспрессируют VE-кадгерин и VEGFR2 в опухоли оказывающие влияние на ангиогенез [17] и индуцируют выделение из красного костного мозга циркулирующих эндотелиальных стволовых клеток-предшественников путем разрушения c-Kit лиганда, данный факт способствует дальнейшей активации опухолевого ангиогенеза [18]. В качестве одного из стимуляторов ангиогенных факторов рассматривается опухоль-ассоциирован- ная гипоксия ткани (рис. 4), под влиянием которой увеличивается экспрессия ММП-9 как в опухолевой ткани, так и в клетках стромального окружения. Так, неоангиогенез, вызванный гипоксией, обусловлен активацией NOX-2. Кроме того описана роль ММП-9 как одного из главных участников такого феномена как «васкулогенная мимикрия», представляющего собой образование микроваскулярной сети опухолевыми клетками, характерного для меланомы кожи [19]. Отмечая роль BRAF-статуса в ангиогенезе следует заметить, что в проводимых ранее исследованиях по изучению взаимосвязи BRAF-статуса и ангиогенеза при опухолях другого гистогенеза, было выявлено, что уровень проангиогенных факторов, таких как VEGF, VEGFR, PDGFRb был ниже у пациентов с наличием мутации BRAF V600E при раке щитовидной железы, чем у пациентов, не имеющих данной мутации, при этом количество как кровеносных так и лимфатических сосудов не зависело от BRAF-статуса [3]. Несмотря на некоторые особенности опухолевого ангиогенеза при меланоме кожи у пациентов, имеющих различный BRAF-статус, кровоток в опухоли находится под влиянием ангиогенных и проангиоген- ных стимулов, которые имеют общие закономерности независимо от BRAF-статуса. Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ, проект № 16-34-00461, мол_а. Конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

Maria B. Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
MD, PhD, docent, Department of Pathophysiology with a Course of a Clinical Pathophysiology, Krasnoyarsk State Medical University of prof. V.F. Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

T. G Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Department of Pathophysiology with a course of clinical pathophysiology Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files