Phenotypic variability of Trichomonas vaginalis as the cause of resistance to metronidazole

Full Text

Актуальным вопросом ведения больных мочеполовым трихомониазом (МТ) является неэффективность лечения метронидазолом. Вопрос о чувствительности штаммов Trichomonas vaginalis неоднократно рассматривали раньше, обсуждают его и в настоящее время. Мнения различных авторов по этому вопросу противоречивы: одни полагают, что неэффективность лечения обусловлена появлением высокорезистентных к метронидазолу штаммов влагалищных трихомонад, другие видят причину в нерационалъных схемах лечения. При этом предполагают, что в эпидемическом процессе имеют значение малосим- птомные, вялые формы болезни, а также трихомонадоно- сительство. При этом, как правило, отсутствуют признаки воспаления, а возбудитель выявляется при рецидивах воспалительных заболеваний у одного из половых партнеров. Трихомонадоносительство способствует эпидемиологическому распространению возбудителя среди половых партнеров. Частота носительства T.vaginalis по данным различных авторов составляет среди женщин 10-35%, а среди мужчин - 2-41% [1-3]. Отмечено, что штаммы простейших, выделенных от уже леченных метронидазолом больных, обладают большей устойчивостью и выдерживают in vitro сублетальные дозы более длительно, чем штаммы влагалищных три- хомонад, выделенные от больных, не получавших ранее лечение. Эффективность терапии зависит не только от биологических свойств микроорганизма, но и от концентрации препарата в сыворотке крови, тканях, скорости его выведения из организма, дозировки лекарственного средства, методики его применения [4-8]. За время использования метронидазола разработано множество схем его применения. Большинство из них неизменно было направлено на увеличение разовых и курсовых доз препарата, что и обусловило катастрофическое нарастание устойчивости T.vaginalis к метронидазолу [9, 10]. Выявлены высокорезистентные штаммы влагалищных трихомонад, у которых уровень чувствительности к метронидазолу варьирует в широких пределах [8, 10-13]. Несмотря на относительно малые размеры, T. vaginalis имеет весьма сложную морфологию и не менее сложный метаболизм. Однако некоторые авторы отмечают, что размеры урогенитальной трихомонады весьма вариабельны и зависят от стадии заболевания, темпов роста, особенностей штамма. A. Kraus [14] полагает, что величина три- хомонад зависит и от стадии заболевания: мелкие особи (8-10 мкм) чаще находят при остром заболевании, крупные (до 30-45 мкм) - при хроническом. Фенотип клетки меняется в зависимости от физикохимических условий среды и фазы роста [3]. Когда трихо- монада прикрепляется к клетке хозяина, она приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки [15], что свидетельствует о значительной модификационной изменчивости T. vaginalis, выполняющей функцию адаптации. Дискутируется вопрос о том, могут ли T. vaginalis кроме активно движущейся с помощью ундулирующей мембраны трофозоидной формы иметь другие фенотипы, в частности неподвижные, безжгутиковые (амастиготные). У эндопаразита окружающая среда может резко меняться на протяжении очень короткого срока (срабатывают механизмы гомеостаза), в связи с чем и процессы изменчивости паразита ускоряются до величин, не встречающихся у свободно живущих организмов. Особенно это заметно по отношению к паразитирующим простейшим, которые могут претерпевать изменения при каждом бесполом размножении. Кроме того, источником наследственной изменчивости в клонах агамных простейших могут быть и механизмы цитоплазматической наследственности [16]. На паразита влияет двоякая среда обитания: среда первого порядка - непосредственно организм хозяина, и среда второго порядка - условия, окружающие хозяина. По данным Э.А. Баткаева, Д.В. Рюмина [17], в течение последних лет среди больных МТ увеличилась частота выявления метаболически малоактивных особей паразита, лишенных органоидов движения (блефаропласта, жгутиков и ундулирующей мембраны). Ранее И.И. Ильин [14] отметил, что у мужчин, чьи жены больны МТ, находят «своеобразные» малоподвижные клетки в нативных препаратах, отличающиеся в окрашенных мазках от «классических» трихомонад и исчезающие после проведения специфической терапии. Многие авторы считают их особой формой трихомонад. К одной из таких атипичных форм относят так называемые «круглые неподвижные формы», обнаруживаемые в нативных препаратах. Считают, что именно эти формы обладают устойчивостью к лекарственным препаратам. «Круглые» формы трихомонад лишены или почти лишены жгутиков и ундулирующей мембраны, но способны к размножению. Одним авторам удалось получить живые типичные культуры при посеве «круглых» форм, другим - нет. Это позволило предположить, что атипичные формы трихомонад являются либо мертвыми клетками, либо особями, вступившими в шизогонию, т.е. множественное деление [18]. Переход трихомонады из одного фенотипа в другой сопровождается одновременной коррелятивной изменчивостью внутреннего строения. Амебовидные трихомонады обладают выраженной фагоцитарной активностью. Предполагают, что эта стадия развития обусловлена активизацией питания и запасанием необходимых для размножения веществ [18]. При этом амебовидные трихомонады обладают выраженной цитотоксичностью по отношению к клеткам хозяина [19]. Круглые, шаровидные трихомонады, размером от 1,5 до 4 мкм, с толстой опалесцирующей оболочкой рассматриваются как почкующиеся или делящиеся особи. Наличие таких форм в мочеполовом тракте затрудняет лечение МТ обычными методами. Задачей настоящего исследования явилось изучение морфологической изменчивости влагалищных трихомо- над под влиянием мутагена нитрозогуанидина, применяемого в биологии для воздействия на геном микроорганизмов и простейших. Материал и методы Нитрозогуанидин (НГ) является одним из самых мощных и широко применяемых мутагенов. Согласно стандартной методике, исходные растворы мутагена готовят непосредственно перед использованием, растворяя его в соответствующем буфере (0,1М нитратный буфер, рН 5,5) до концентрации 1 мг/мл. Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50-500 мкг/мл. Для воздействия на трихомонады, рабочую концентрацию мутагена получали путем разведения мутагена с помощью ацетатного буфера (рН 7,4) или питательной среды для выращивания трихо- монад. Суточную культуру трихомонад с признаками обильного роста (трихомонады в контрольной капле на предметном стекле покрывали все поле зрения) осаждали центрифугированием, промывали буферным раствором в количестве 5 мл (3 раза). После осаждения культуру в количестве 1 мл вносили в 5 пробирок, содержащих по 5 мл питательной среды для выращивания три- хомонад. Первая пробирка (контроль) - без мутагена, в остальные вносили мутаген в концентрациях 50, 100, 150, 500 мкг/мл и инкубировали 15 мин при температуре 37 °С. После инкубации культуру вновь осаждали центрифугированием (1000 об/мин) и отмывали фосфатным буфером в количестве 5 мл 3 раза. После удаления буфера к осадку добавляли питательную среду для выращивания трихомонад в количестве 5 мл и оставляли в термостате при температуре 37°С на ночь. Культуру простейших оценивали ежедневно микроскопией нативного препарата со спущенным конденсором (окуляр 10, объектив 40, увеличение 400). Согласно стандартной методике для эксперимента отбирали культуру трихомонад, в которой выживаемость простейших составляла примерно 50%. Пригодную для эксперимента культуру распределяли тонким слоем по поверхности предметного стекла, высушивали на воздухе при комнатной температуре и окрашивали красителем для быстрого окрашивания по методу Романовского (Лейкодифф, «Лахема»). Показателем прекращения просмотра мутированных образцов являлась полная гибель простейших. Результаты Разнообразие морфотипов T.vaginalis под влиянием мутагена. а - трихомонада без аксостиля; б - трихомонады с измененными ядрами без аксостиля; в - овальная форма трихомонады с измененным ядром; г - деление влагалищной трихомонады почкованием; д - безжгутиковые формы влагалищных трихомонад; е - полиморфизм влагалищных трихомонад. Отдельно лежащие жгутики. Под влиянием мутагена в течение 15 и 30 мин наблюдалось образование колоний простейших по 50-100 особей в каждой. При этом отмечена своеобразная ориентация трихомонад: головной конец с активно движущимися жгутиками располагался снаружи. Наблюдался выраженный полиморфизм простейших: помимо типичных грушевидных форм трихомонад в колониях присутствовали круглые и овальные особи, содержащие в протоплазме обилие питательных частиц, а также мелкие, крупные и гигантские. Иногда наблюдались необычные удлиненные формы простейших. В центре колоний, как правило, располагались крупные трихомонады, а вокруг мелкие, фиксированные ши- пиками к поверхности крупных особей. Живые трихомонады нередко были в одной колонии с мертвыми. У округлых форм трихомонад часто наблюдался дефект опорного аппарата - аксостиля. Помимо особей с обычным аксостилем, заканчивающимся шипиком, в препаратах встречались простейшие с укороченным, изогнутым аксостилем или без него (см. рисунок, а, б). Иногда наблюдались округлые безжгутиковые формы трихомонад, лишенные аксостиля. По мере увеличения продолжительности инкубации трихомонад с мутагеном, в культуре увеличивалось число единичных свободнодвижущихся простейших, уменьшалось их количество в колониях, увеличивался полиморфизм. Преобладали овальные морфотипы простейших (см. рисунок, в). Отмечены единичные многоядерные трихомонады с множественными жгутиками на поверхности мембраны и безъядерные особи. Движения жгутиков медленные. У некоторых особей отмечено образование вакуолей в протоплазме и возникновение каплевидных образований на поверхности (см. рисунок, г). Иногда единичная круглая вакуоль занимала почти все внутреннее пространство простейшего. Через 24 ч от момента введения мутагена в культуру наблюдалось активное движение простейших (толчкообразные движения по прямой, вращение по часовой и против часовой стрелки). Характерно активное толчкообразное выбрасывание жгутиков и притягивание с их помощью плавающих в растворе эпителиальных клеток и питательных частиц. У шаровидных форм трихомонад отмечены медленные движения жгутиков. Изменялся тип движения простейших - от характерных толчкообразных до маятникоподобных. В случае наличия в питательной среде эпителиальных или дрожжеподобных клеток или нитей мицелия наблюдалась фиксация трихомонад на их поверхности. При этом обращали на себя внимание гигантские формы дрожжеподобных клеток по сравнению с контролем. Под влиянием мутагена простейшие активно поглощали питательные частицы из окружающей среды. В отличие от «классической» удлиненной формы в виде косточки сливы, в эксперименте наблюдались простейшие с измененной формой ядра: округлым, овальным, удлиненным, изогнутым. Иногда в ядре наблюдались округлые полости. В экспериментальных образцах помимо одноядерных особей наблюдались двухъядерные и многоядерные формы трихомонад. Отмечены единичные многоядерные особи с множественными жгутиками на поверхности мембраны и безъядерные формы. В контрольном образце трихомонады располагались, как правило, вокруг эпителиальных клеток. Контуры простейших ровные, окраска равномерная, протоплазма мелкозернистая. При окраске по Романовскому-Гимза хорошо видны жгутики и аксостиль. Под воздействием мутагена в образцах увеличивалось количество фиксированных к эпителиальным клеткам трихомонад различной величины, формы, отличающихся тинкториальными свойствами. Трихомонады прикреплялись к поверхности клеток шипиками, головной конец простейшего со жгутиками - наружу. Признаками старения и потери простейшими жизнеспособности являлось изменение тинкториальный свойств - усиление восприимчивости трихомонад к красителям (более темная окраска), интенсивное прокрашивание жгутиков и аксостиля. Под влиянием мутагена возникали безжгутиковые формы простейших (см. рисунок, д). Нередко жгутики (единичные или в пучках) удавалось обнаружить вблизи от таких форм трихомонад (см. рисунок, е). Неожиданным свойством мутированных трихомонад явилось увеличение продолжительности их жизни на 5-7 дней по сравнению с контрольным образцом. Гибель простейших в культуре наблюдалась через 5-7 дней, после воздействия мутагеном - через 8-12 дней. Обсуждение Нитрозогуанидин - химическое вещество, мощный мутаген, воздействующий на геном микроорганизмов и простейших. Проведенное исследование показало, что под влиянием мутагена увеличивалась жизнеспособность трихомонад, усиливался полиморфизм простейших и появлялись безжгутиковые формы. По мнению ряда авторов [2, 15, 20], причиной появления безжгутиковых и округлых форм является изменение условий внешней среды. Следовательно, безжгутиковые формы - одна из стадий развития простейшего, форма приспособления к изменению условий окружающей среды. Важно отметить, что появление в культуре безжгути- ковых форм простейших наблюдалось только при воздействии сильным раздражителем (мутагеном), вызывающим изменения на уровне генома. Слабый раздражитель - низкоинтенсивный лазер, действующий на уровне ковалентных связей, не оказывал подобного действия [25]. Проявлением действия мутагена является изменение ядер и опорного аппарата простейшего. Круглые формы T. vaginalis рассматриваются как этап самосохранения, выявляются после лечения и способствуют рецидивам заболевания [22]. Прикрепляясь к клетке хозяина T. vaginalis приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки. Для данной морфологической формы T. vaginalis характерна выраженная цитотоксичность по отношению к клеткам хозяина. Изменение фенотипа T. vaginalis зависит от фазы роста и физико-химических факторов среды и сопровождается коррелятивной изменчивостью внутреннего строения, характеризуя ее высокие адаптационные возможности [11, 23, 24]. Многоядерные трихомонады с множественными жгутиками на поверхности мембраны представляют собой не что иное, как колонию простейших, образованную в результате изменения характера размножения по типу шизогонии или палинтомии [15, 20]. Процесс последовательных делений без стадии роста напоминает дробление яйца многоклеточных животных. С нашей точки зрения, колонии простейших с характерной ориентаций жгутиками наружу и прикреплением шипиками к поверхности крупной или гигантской трихомонады, эпителиальной клетки или мицелию, следует рассматривать как проявление адаптации простейшего к неблагоприятным условиям внешней среды, а усиление питания - как необходимую меру для обеспечения его жизнедеятельности. Выявленные морфотипы влагалищных трихомонад могут быть связаны с особенностями адаптации простейших к изменению условий окружающей среды или с размножением. По мнению Н.М. Овчинникова [15] различные типы деления наблюдаются не как закономерная последовательность в жизненном цикле простейшего, а представляют собой различные реакции приспособления к изменяющимся условиям среды. Поэтому круглые, овальные, многоядерные, безъядерные формы вряд ли можно назвать атипичными, скорее всего, это лишь разные стадии развития паразита. Самый распространенный способ деления простейших - бесполый (размножение делением надвое). Плоскость деления всегда совпадает с продольной осью тела. Сначала делится митотическое ядро, затем, начиная с переднего конца, все тело простейшего, в том числе и жгутики. При этом старый жгутик иногда отходит к одной из дочерних особей, а у второй образуется из кинетосомы. В других случаях жгутик отбрасывается и в обеих дочерних особях образуется вновь [20]. Выявление мутированных длительно живущих форм трихомонад (продолжительность жизни увеличивалась на 5-7 дней по сравнению с контролем) является важным результатом эксперимента. Не исключено, что внутренние и внешние факторы среды обитания могут оказывать мутирующее действие и вызывать у простейшего изменение на уровне генома, тем самым, способствуя появлению длительно живущих и резистентных к метронидазолу форм трихомонад, обладающих выраженными адаптивными способностями, обеспечивающими их выживание в экстремальных условиях. Не исключено, что случаи вялотекущего и трудно поддающегося лечению МТ, обусловлены наличием именно амастиготных (безжгутиковых) форм простейших с измененным геномом, обладающих повышенным потенциалом к выживаемости. Результаты проведенного исследования открывают новые возможности в изучении причин устойчивости влагалищных трихомонад к метронидазолу, намечают новые пути проведения исследований, направленных на выявление факторов, способных в условиях in vivo вызывать мутации у простейших и повышать их устойчивость к медикаментозным средствам. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Natalie I. Syuch

P.V. Mandryka Central Military Clinical Hospital

Email: nsyuch@gmail.com
Doctor of Medical Sciences, Professor 107014, Moscow, Russia

K. E Machkalyan

P.V. Mandryka Central Military Clinical Hospital

107014, Moscow, Russia

N. V Makhneva

Moscow Regional Research Clinical Institute

129110, Moscow, Russia

References

Supplementary files