Dependence of the microRNA profile in cutaneous melanoma on clinical and morphological characteristics of the tumor

Full Text

Меланома - агрессивное злокачественное новообразование, которое характеризуется быстрым ростом и высокой смертностью больных (до 80% от всех случаев смерти при злокачественных новообразованиях кожи) [1]. Выделяют четыре основных клинических варианта опухоли: поверхностно распространяющаяся, узловая, акральнолентигинозная и лентиго-меланома [2]. Несмотря на то что изначально такой способ классификации меланомы кожи был основан на морфологических признаках, не затрагивая ни молекулярные особенности, ни прогноз для пациента, на сегодняшний день существуют данные, что течение данного заболевания зависит от клинической формы [3]. В связи c этим вероятно, что клинические формы меланомы могут иметь не только морфологические, но и молекулярно-генетические и биохимические различия [4]. Выявление этих различий может быть важным шагом на пути к персонифицированной терапии заболевания. Кроме характеристик самой опухоли, существует ряд достоверных факторов влияния особенностей самого пациента на течение заболевания, таких как его пол или возраст. Известно [5, 6], что больные женского пола имеют более высокие показатели выживаемости при меланоме и более длительное время до возникновения первых метастазов, чем больные мужского пола. Кроме того, у пациентов старшего возраста отмечается ускоренный переход к стадии метастазирования и увеличение устойчивости меланомы к терапии в сравнении с молодыми пациентами [7]. МикроРНК - малые белокнекодирующие молекулы РНК, состоящие из 18-24 нуклеотидов и выполняющие в клетке регуляторные функции [8]. На сегодняшний день известны сотни различных микроРНК, которые регулируют экспрессию до 60% генов человека. Многочисленные исследования доказывают участие этих молекул в регуляции большинства клеточных процессов и их роль в развитии заболеваний, в том числе злокачественных новообразований [9]. При этом показано, что соотношение уровней различных микроРНК (профиль микроРНК) в клетках изменяется в процессе малигнизации, становясь специфичным для отдельного заболевания [10]. В частности, было показано изменение уровней экспрессии микроРНК в малигнизированных меланоцитах в сравнении с добокаче- ственными меланоцитарными невусами [11]. Более того, уровень некоторых микроРНК варьирует при прогрессии опухоли, переходе от стадии к стадии, что указывает на наличие не совсем понятных на сегодняшний день изменений и роли данного типа молекул в развитии опухоли [12]. Учитывая возможность участия микроРНК в большинстве биологических процессов клетки, можно предположить, что и различия в протекании меланомы, обусловленные возрастом, полом пациента или клинико-морфологическими характеристиками самой опухоли, могут иметь отражение в профиле микроРНК, их выявление могло бы стать основой для индивидуализированной терапии заболевания. Цель данного исследования - определение изменения профилей микроРНК в меланоме кожи в зависимости от пола, возраста, толщины опухоли по Бреслоу и клинической формы новообразования. Материал и методы Исследование одобрено локальным этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (протокол № 59/2014 от 02.12.2014). Биопсийный материал меланомы (п = 15) был предоставлен Красноярским краевым патологоанатомическим бюро. Ткани после оперативного иссечения фиксировали 10% раствором нейтрального формальдегида и заключали в парафин по стан- Таблица 1 Клинические данные о больных меланомой кожи, включенных в исследование Пол больного Возраст, годы Толщина опухоли по Бреслоу, мм Локализация опухоли Клиническая форма Мужской 46 5,8 Ногтевая фаланга 1-го пальца кисти Акральнолентигинозная Женский 50 4 Ногтевая фаланга 5-го пальца стопы Акральнолентигинозная Мужской 63 3 Стопа (пяточная область) Акральнолентигинозная Мужской 56 6,85 Фаланга кисти Акральнолентигинозная Женский 36 3,62 Спина Лентиго Женский 35 4,46 Бедро Лентиго Мужской 50 5,8 Предплечье Лентиго Женский 81 5 Правое плечо Метастаз Женский 41 3,2 Ушная раковина Поверхностно распространяющаяся Женский 75 4 Нижняя треть плеча Поверхностно распространяющаяся Женский 51 4,27 Передняя брюшная стенка Поверхностно распространяющаяся Мужской 66 7,07 Спина Узловая Мужской 73 2 Правое плечо Узловая Мужской 62 3 Спина Узловая Женский 52 2 Левая надлопаточная область Узловая дартной методике. После фиксации образцы сохраняли при комнатной температуре. Подтверждение гистологического диагноза меланомы кожи осуществлялось врачом-патологоанатомом. Информация о пациентах, включенных в исследование, представлена в табл. 1. Для выделения РНК образцы подвергали предварительной диссекции на срезы толщиной 15 мкм с помощью микротома. Диссектированную ткань депарафинизировали ксилолом с дальнейшей отмывкой 96% этанолом, затем ткань высушивали на воздухе и заливали 200 мкл буферного раствора, предназначенного для оптимальной работы протеиназы К (компонент Digestion buffer набора RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation kit, “Ambion”, США). Обработку протеиназой К производили в следующем температурном режиме, рекомендованном для выделения РНК: при температуре 50 °С 15 мин, затем при 80 °С 15 мин. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения нуклеиновых кислот RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation kit (“Ambion”, США) строго в соответствии с протоколом производителя. Для элюции РНК использовали воду без нуклеаз. Концентрацию микроРНК определяли на приборе Qubit 2.0 (Сингапур) с использованием специфичных к микроРНК реагентов Qubit® microRNA Assay kit (ref. Q32880, “Eugene”, США). Для дальнейшего анализа методом микрочипирования применяли образцы с концентрацией микроРНК не менее 16,5 нг/мкл. Для микрочипирования использовали систему GeneAtlas Microarray System (“Affymetrix”, США). Для каждого микрочипа было взято не менее 130 нг микроРНК образца в объеме 8 мкл. Перед гибридизацией микроРНК предварительно подвергали полиаденилированию и биотинилированию с использованием комплекта реагентов Flash TagHSR Biotin Labeling Kit (ref. 901913; “Affymetrix”, США). МикроРНК, меченные биотином, подвергали гибридизации на микрочип в стрипе Affymetrix miRNA 4.1 ArrayStrip (“Af- fymetrix”, США) при температуре 48 оС в течение 20 ч. Данный микрочип содержит ячейки для гибридизации и оценки уровня 6599 малых некодирующих РНК человека в соответствии с базой микроРНК версии v.20. По окончании гибридизации проводили отмывку и окраску микрочипа в автоматическом режиме в модуле Fluidic Station системы GeneAtlas с использованием растворов из комплекта Gene Chip Gene Atlas Hybridization and Stain Module (ref. 902135, “Affymetrix”, США). Детекцию интенсивности свечения биотина в ячейках микрочипа производили в детек- ционном модуле системы Gene Atlas (Imaging Station). Оценку качества эксперимента проводили с помощью внешних контролей, вводимых в образцы на каждом этапе пробоподготовки и гибридизации: внешние контроли полиаденилирования и биотинилирования (spike control oligos) (Flash TagHSR Biotin Labeling Kit (ref. 901913,“Affymetrix”, США), антисмысловые меченные биотином короткие РНК - контроли гибридизации bioB, bioC, bioD и cre (20Х Hybridizationcontrols) и контроль, меченный биотином (Control Oligo B2), из комплекта реагентов Gene Chip Hybridization Control Kit (ref. 900454, “Affymetrix”, США). Контроль качества (QC) проводили с помощью программного обеспечения Gene Atlas посредством оценки интенсивности свечения ячеек микрочипа, содержащих контрольные молекулы. Анализ данных свечения с преобразованием в уровни экспрессии осуществляли с помощью программы Expression Console (“Affymetrix”, США). Для статистической обработки данных микрочипирования использовали программное обеспечение Transcriptome Analysis Console 3.0 (“Affymetrix”, США), использующее непараметрический метод анализа ANOVA. Корректировку значимости различий экспрессионных профилей проводили с помощью критерия false discovery rate (FDR), предложенного Y Benjamini, Y Hochberg [13] для множественных сравнений. Различия в данных рассматривали как статистически значимые при р < 0,05. Анализ сигнальных путей проводили с помощью электронного ресурса Dianami Rpath 2.0 [14]. Единство сигнальных путей оценивали путем построения диаграммы Эйлера-Венна с помощью электронного ресурса Bioinformatics & Evolutionary Genomics (http:// bioinformatics.psb.ugent.bewebtools/Venn). Результаты Для оценки взаимосвязи между характером профиля микроРНК в меланоме и возрастом пациента провели сравнение образцов в двух группах: 1- я группа - 9 больных в возрасте до 60 лет включительно (от 35 до 56 лет); 2- я группа - 6 больных в возрасте старше 61 года (от 62 лет до 81 года). При анализе с помощью ANOVA-теста выявлено различие в уровнях 60 микроРНК. Однако корректировка данных по критерию FDR, позволяющему учитывать вероятность ложноположительных результатов, показала отсутствие значимых различий в профилях микроРНК в этих группах (значение р, откорректированное по FDR, составило от 0,54 до 0,65). Сравнение профилей микроРНК в меланоме у 8 мужчин и у 7 женщин также не показало значимых различий (значение p, откорректированное по FDR, составило от 0,52 до 0,65). Таким образом, возраст и пол пациента не являются факторами, обеспечивающими особенности экспрессии профиля микроРНК. Значимых различий также не выявлено при оценке взаимосвязи уровней микроРНК в клетках с толщиной опухоли по Бреслоу. Сравнение групп меланомы с толщиной менее 4 мм и более 4 мм показало сходство в них профилей (значение р, откорректированное по FDR, составило 0,96). Далее была оценена взаимосвязь профиля микроРНК и клинической формы меланомы. Для этого, согласно представленным в табл. 1 данным, образцы разделили на 4 группы по клиническим формам: поверхностно распространяющаяся меланома, узловая меланома, лентиго-меланома и акрально-лентигинозная меланома. При анализе данных с учетом FDR было показано наличие значимых различий в профилях микроРНК по 40 микроРНК (значение р, откорректированное по FDR, составило для них от 0,0034 до 0,0493). При построении иерархической кластерограммы (рис. 1) выявлено четкое выделение профилей микроРНК образцов поверхностно распространяющейся меланомы и узловой меланомы, в то время как профили микроРНК лентиго-меланомы и акрально-лентигинозной меланомы характеризовались схожей картиной. При анализе различающихся микроРНК было выявлено, что большинство из них имеют отличный от других форм уровень экспрессии именно в образцах поверхностно распространяющейся меланомы (табл. 2). При этом различия наблюдаются в уровнях как зрелых микроРНК (29 из 40 видов молекул), так и в предшественниках микроРНК (пре-микроРНК, 11 видов молекул). Согласно программному разделению и визуальной оценке различий, микроРНК были выделены в 5 отдельных кластеров микроРНК по уровням экспрессии в клетке. В первых трех кластерах оказались микроРНК, имеющие значимо более низкий уровень в образцах поверхностно распространяющейся меланомы в сравнении с другими формами опухоли. Анализ сигнальных путей, регулируемых микроРНК в этих кластерах, выявил общность их участия в процессах, ассоциированных с развитием рака предстательной железы, почечно-клеточного рака, немелкоклеточного рака легких, хронического и острого миело- лейкозов, а также фундаментальных процессов, связанных с прогрессией злокачественных новообразований: «нарушение регуляции транскрипции при раке», «сигнальные пути при раке» (рис. 2). Также данные микроРНК были ассоциированы с регуляцией процессов меланогенеза в клетках. Отмечено участие микроРНК, измененных в образцах поверхностно распространяющейся меланомы, в нарушениях регуляции транскрипции при онкологических заболеваниях (кластеры 1 и 2), р53-сигнальном пути и деградации РНК (кластеры 1 и 3), сигнальных путях митоге- нактивируемых протеинкиназ (MAPK), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (кластер 3), трансформирующего фактора роста (TGFP) (кластер 2). Для микроРНК кластера 3 выявлено участие в сигнальных механизмах, связанных собственно с развитием меланомы («сигнальный путь меланомы» hsa05218; p = 0,000072). В кластере 4 микроРНК miR-7977 и miR-7975 имели повышенный уровень в поверхностно распространяющейся меланоме. На настоящий момент эти микроРНК изучены недостаточно, и потому предположить их участие в формировании той или иной клинической формы меланомы затруднительно. Кластер 5 объединил микроРНК, которые имеют различные уровни экспрессии при разных формах меланомы. Эти данные имели разрозненный характер и не поддавались систематизации. Отмечено, что именно в кластере 5 расположены предшественники микроРНК. Обсуждение Понимание молекулярных механизмов развития опухолей различных подтипов является важным для разработки методов индивидуальной терапии злокачественных новообразований. При этом в отношении многих онкологических заболеваний отмечается переход от более ранних классификаций, основанных на гистологических признаках [15], к попыткам выделения подтипов опухоли по отдельным гистологическим, а также молекулярным и биохимическим характеристикам [16-19]. В настоящей работе проведен анализ связи между клинико-морфологическими формами меланомы и особенностью протекания в ней молекулярно-биологических процессов. Подразделение меланомы на гистологические формы определяет поверхностно распространяющуюся меланому как образование, состоящее из бессистемно разбросанных в эпидермальном слое кожи клеток - как одиночных, так и в виде скоплений. На начальном этапе развития опухоль характеризуется радиальным ростом и слабо инвазирует. Однако на более поздних стадиях она переходит в фазу вертикального роста, приобретая сходные черты с узловой формой меланомы и повышая вероятность метастазирования. Данная форма опухоли является самой распространенной и встречается примерно в 75% случаев меланомы кожи, возникая у людей разных возрастов (средний возраст 40-50 лет) и локализуясь на разных участках кожи [20]. В отличие от нее узловая меланома, представляющая 10-15% случаев меланомы кожи, не имеет выраженной фазы радиального роста, сразу распространяясь преимущественно вертикально. При этом в ранних исследованиях скорость дермальной инвазии рассматривали как основное отличие этих двух форм меланомы, тогда как по большинству других признаков их расценивали как сходные [21]. Последние исследования показывают более глубокие различия между данными вариантами меланомы, проявляющиеся в том числе на молекулярном уровне [3, 22]. Полученные нами данные согласуются и расширяют эти знания, указывая на возможную обособленность поверхностно распространяющейся меланомы по патогенезу от других форм меланомы, в первую очередь от акрально-лентигинозной формы и лентиго-меланомы. В данном исследовании выявлено, что при поверхностно распространяющейся меланоме наблюдается изменение регуляции сигнального пути ErbB-рецептора фактора эпидермального роста клеток. По данным литературы [23], уровни экспрессии рецепторов эпидермального роста в меланомах в фазе радиального роста отличаются от таковых меланом, растущих вертикально, что соотносится с данными микроэррея. Изменения в сигнальных путях MAPK, TGFP, регулирующих рост опухоли, пролиферацию клеток, также могут указывать на особенности в характере роста клеток, поскольку известно, что уровень TGFP изменяется при прогрессии меланомы и переходе в стадию метаста- зирования [24]. Однако в силу двойственной роли TGFP на разных стадиях меланомы [25] характер его влияния на развитие поверхностно распространяющейся меланомы требует дальнейшего разъяснения. Мы не нашли различий между клиническими формами в уровнях тех микроРНК, которые представляются характерными маркерами меланомы, «классическими» онкогенами или онкосупрессорами (miR-155, miR-205, miR-21, 1й-7Ьи многих других) [17, 26, 27]. Очевидно, что при наличии значимых различий в профилях фундаментальные механизмы развития меланомы сохраняются однотипными, и различия в большей степени касаются лишь особенностей протекания заболевания. Однако в поверхностно распространяющейся меланоме было отмечено снижение уровня miR-149-3p, которой приписывают участие в формировании иммунного ответа при меланоме [28]. Это позволяет предположить особенности формирования иммунных реакций при поверхностно распространяющейся меланоме. Данные о различиях в функционировании компонентов системы иммунобиологического надзора в зависимости от подтипа меланомы отмечались и ранее. В частности, известно, что узловая форма меланомы характеризуется более низким уровнем опухоль-инфильтри- рующих лимфоцитов, что также позволяет предположить различия в характере и выраженности иммунного ответа при разных подтипах опухоли [29]. Анализ профиля экспрессии мРНК определил четыре подтипа меланомы в зависимости от экспрессионного паттерна: «высокоиммунный», «обычный», «пигментный, связанный с высокой экспрессией MITF», а также «пролиферативный, ассоциированный с низкой экспрессией MITF» [18]. Обсуждается практическая значимость подобной классификации, а также ее соотнесение с молекулярной классификацией, созданной в ходе выполнения международного проекта «Атлас ракового генома», где выделены три формы меланомы: «иммунный», «кератиновый», «ассоциированный с низкой экспрессией MITF» [30]. Важность распределения больных меланомой в соответствии с молекулярными подтипами обусловлена не только отличиями в течении заболевания, но и сопряжена с индивидуализированным подбором противоопухолевой терапии. В частности, указывается, что больные «высокоиммунным» подтипом опухоли характеризуются более высокими показателями выживаемости и могут являться группой выбора для терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа. В нашем исследовании не было выявлено связи между молекулярным типом опухоли и возрастом/полом больного, что указывает на возможное отсутствие влияния данных признаков на молекулярные механизмы развития опухоли. E. Chan и соавт. [4] показали изменение уровней ряда микроРНК в акрально-лентигинозной меланоме в сравнении с другими клиническими вариантами опухоли. В нашем исследовании таких различий не выявлено, однако оба исследования указывают на возможную взаимосвязь между клинической формой меланомы и особенностями экспрессионного профиля микроРНК. Таким образом, разделение меланом по клинико-морфологическим типам может быть ассоциировано с особенностями экспрессионного профиля микроРНК. Дальнейшее исследование молекулярных подтипов опухоли на основе особенностей различных молекулярных изменений является необходимым для более эффективного прогнозирования развития и течения данного заболевания, а также использования стратегий персонифицированной терапии. Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-15-00074). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. V Komina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

N. V Palkina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

M. B Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

Tatyana G. Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
Dr. Sci. Med., Head of Department of pathophysiology Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files