The influence of peptide bioregulators on skin aging in 3D culture model

Full Text

Достижения в исследовании регуляции деления, созревания и жизнедеятельности клеток постоянно формируют новые знания о развитии процессов старения кожи и позволяют разрабатывать новые подходы и методы анти- возрастной терапии. Снижение скорости клеточного обновления кожи - ключевой момент в развитии процессов ее старения. В последние годы показано, что клеточное обновление и восстановление кожных покровов осуществляются за счет постоянно протекающих процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, расположенных на базальной мембране эпидермиса и по границе волосяных фолликулов. Стволовые клетки (СК) базального эпидермиса поддерживают пул кератиноцитов, СК волосяного фолликула являются мультипотентными, способными дифференцироваться как в кератиноциты, так и в фибро- бласты и другие клетки дермы [1, 2]. Основной функцией СК является физиологическая замена отслуживших дифференцированных клеток кожи и восстановление клеточного пула. Стволовые клетки можно назвать «машинами регенерации», но для их активации необходимы цитокины, факторы роста и другие сигнальные молекулы, синтез которых регулируется как стволовыми клетками, так и их микроокружением («нишей»). Клеточное окружение («ниша») обеспечивает ключевые инструктивные сигналы для выбора «судьбы» клеток - сохранять идентичность стволовой клетке либо дифференцироваться в зрелые специализированные клетки [3]. В стареющей коже вследствие клеточного обеднения и снижения синтетической активности клеток развивается «дефицит» цитокинов, ростовых факторов, сигнальных, регуляторных молекул. Количество синтезируемых клетками информационных сигнальных молекул становится недостаточным для активации пролиферации стволовых клеток. Стволовые клетки не работают, не активизируются и не пролиферируют без активного микроокружения, то есть без достаточного количества ростовых факторов, цитокинов и сигнальных молекул. Возникает необходимость внесения «внешнего» стартового сигнала, чтобы дать толчок к началу пролиферации СК и последующему клеточному обновлению. Известно, что изучаемый препарат способствует синтезу биологически активных молекул в различных клетках кожи: кератиноцитах, фибробластах, моноцитах. Все вместе они создают тот «каскад цитокинов», ростовых факторов и сигнальных молекул, которые активируют пролиферацию собственных стволовых клеток. Ключевой компонент препарата Wharton Jelly Peptide P199™ действует по отношению к собственным стволовым клеткам как сигнальный фактор. Именно этот пептид инициирует глубокие стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже. Для подтверждения антивозрастной эффективности изучаемого мезотерапевтического препарата могут быть использованы разные объекты исследования - культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, мелано- циты и дермальные фибробласты человека [3]. Дермаль- Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования. а - опытная культура фибробластов (Р18) - соответствует зрелой (стареющей) кожи; б - контрольная культура фибробластов (Р4) - соответствует молодой коже. ные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия [4, 5]. Фибробласты продуцируют проколлаген, фи- бронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста [6, 7]. Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран [8, 9]. Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию [10, 11]. При длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры [12]. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем, последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций. Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности - эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность [13, 14, 15]. 3D культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением - необходимым условием полноценного морфогенеза. Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния инъекционного препарата для мезотерапии Meso-Wharton Р199ТМ как в 2D, так и в 3D культурах дермальных фибробластов человека. Материал и методы Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентамицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресу- спендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10% сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 х 1052 х 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (37 оС, 5% СО2). Культивировали до 4-го пассажа (Р4), оха- рактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и крио- консервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные. Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при температуре 37 оС, отмывали от остатков сыворотки и ди- метилсульфоксид раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин при 1000g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (37 оС, 5% СО2). Культивировали до 18-го пассажа (Р18), когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженную, не пассированную культуру Р4 считали контрольной, и она соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. Для исследования дозозависимого эффекта изучаемого препарата на 2D культуре его смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D культуре дермальных фибробластов Р18. Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на 1 лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления препарата. Клетки культивировали в присутствии препарата в течение 72 ч, далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флюоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (“Olympus”, Япония). Анализ биоактивности проводили на 2D культуре дермаль- ных фибробластов помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, а-гладкомышечного актина (aSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов типов I, III и IV. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимиче- ского анализа клетки культивировали в присутствии препарата в течение 72 ч, далее фиксировали в 4% растворе параформальдегида (4 оС, 20 мин). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, а-гладкомышечному актину (aSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам типов I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флюорохромами FITC (E = 525 нм) и DyLight 594 (E = 617 нм). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (“Olympus”, Япония). Для изучения влияния мезотерапевтического препарата на образование сфероидов из дермальных фибробластов Рис. 2. Экспрессия маркеров контрольной культуры фибробла- стов (Р4). а - цитокератин 19, эластин; б - коллагена типа III; в - коллагена типа I. Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18). а - экспрессия цитокератина 19, эластина; б - экспрессия коллагена типа III; в - экспрессия коллагена типа I. Рис. 4. Экспрессия цитокератина 19 и эластина в фибробластах (Р18) после сокультивирования с препаратом. Ядра клеток докрашены Hoechst 33258 (синий) (а, б) и без добавления препарата (в). а - ув. 10; б - ув. 40; в - ув. 10. исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата для мезотерапии. Для данного этапа исследования использовали изучаемый инъкционный препарат, содержащий пептид Р199, смешанный с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч, отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 х 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (“СМ Technologies”, Финляндия) в течение 7 дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробласстов четвертого пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления препарата. Результаты и обсуждение В культуре дермальных фибробластов Р18, которую использовали для дальнейших исследований, как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (рис. 1, а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (рис. 1, б). По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура Р18 также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератин 19, эластин, коллагены типов I, III 18 пассаж -P199 18 пассаж +P199 Рис. 5. Влияние препарата на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия. и IV), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (рис. 2, а-в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия этих маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной (рис. 3, а-в). Результаты исследования дозозависимости препарата на 2D культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксиче- ских различий эффекта препарата при разведениях, для исследования его биоактивности использовали разведение 1:10. Эластин, объем которого составляет всего 2% от общего объёма белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает коже упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи. Коллаген - фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены типов I, II, III, V; сетевидный коллаген - коллаген типа IV, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген - коллаген типа VI. Рис. 6. Экспрессия эластина. Рис. 7. Экспрессия цитокератина 19. а - сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом; б - сфероид из фибробластов Р18 без препарата; в - сфероид из фибробластов Р4 (контроль). жт W : У Г ^ V, ” ‘ -v.-. а - сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом; б - сфероид из фибробластов Р18 без препарата; в - сфероид из фибробластов Р4 (контроль). Рис. 8. Экспрессия коллагена типа IV. а - сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом; б - сфероид из фибробластов Р18 без препарата; в - сфероид из фибробластов Р4 (контроль). 7 Ч J&C-: v\.V* ■ 1 ‘ г* Рис. 9. Экспрессия фибронектина (зеленый). а - сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом; б - сфероид из фибробластов Р18 без препарата; в - сфероид из фибробластов Р4 (контроль). В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (тип I и III) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70% от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена типа I составляет 80%, а типа III - приблизительно 15% от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1% в год. Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина 19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи увеличивается после со- культивирования с мезотерапевтическим препаратом, по сравнению с контрольной группой (рис. 4, а-в). Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако, такая 2D клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточнуюорганизацию,вкоторойклеткивзаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя, таким образом, уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но не полностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D в 3D условия культивирования. Одним из вариантов 3D клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру - сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов а5 и pi фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождается утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов. Кроме того, 3D клеточные культуры более стабильны, чем 2D клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени - более 3 мес, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутсвии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов. На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках 12 ч, 24 ч, 3, 5 и 7 сут. после помещения культур в ростовую среду с целью изучения их способности образовывать сфероиды. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом, смешанного с ростовой средой, уже через 12 ч наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7-м суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без препарата, через 12 ч образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружним слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида. Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде исследуемого препарата стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата практически все клетки экспрессировали эластин (рис. 6, а-в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин 19 (рис. 7, а-в). Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов типов I и III. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена типа IV было обнаружено, что после сокультивирования с исследуемым препаратом практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена типа IV - основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (рис. 8, а-в). Также было установлено, что данный мезотерапевтический препарат положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (рис. 9, а-в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток [6]. Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения исследуемого препарата для омоложения кожи. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

K. V Kozhina

The Center for Restorative Medicine

117997, Moscow, Russia

E. N Volkova

The Center for Restorative Medicine

117997, Moscow, Russia

I. N Saburina

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Russian Medical Academy for Post-Graduate Education

125315, Moscow, Russia

Sergey G. Morozov

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: biopharm@list.ru.
Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of Russian Academy of Sciences, deputy director for scientific work 125315, Moscow, Russia

I. M Zurina

Institute of General Pathology and Pathophysiology

125315, Moscow, Russia

N. V Kosheleva

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Lomonosov Moscow State University

125315, Moscow, Russia

A. A Gorkun

Institute of General Pathology and Pathophysiology

125315, Moscow, Russia

A. A Grigorieva

The Center for Restorative Medicine

117997, Moscow, Russia

References

Supplementary files