Molecular genotypic detection of beta human papillomavirus DNA in the diagnosis of their association with certain skin epithelial neoplasias in immunocompromised and immunocompetent patients in the mode Real-Time

Full Text

Вирус папилломы человека (ВПЧ) является одним из самых распространенных в мире. В настоящее время охарактеризовано около 200 генотипов вирусов папиллом, инфицирующих человека, млекопитающих и птиц; из них к родам, инфицирующим человека, относят а, в, у, д и п [1]. Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что ВПЧ рода в способны вызывать развитие ряда эпителиальных опухолей кожи (ЭОК), однако данная взаимосвязь в настоящее время до конца не изучена. Среди здоровых людей чаще наблюдается латентное инфицирование ВПЧ рода в кожи, при которой ВПЧ может выступать компонентом нормальной микрофлоры, обитая в волосяных фолликулах [1, 2]. Геном ВПЧ обычно персистирует в эписомальной форме. Иммуносупрессия - важный ко-фактор развития ЭОК и может служить моделью для изучения роли вирусов в развитии как доброкачественных, так и злокачественных ЭОК [2]. Известно, что развитие ВПЧ-ассоциированных бородавок и кератотических кожных высыпаний неуклонно повышается после трансплантации [3]. Выявление ВПЧ рода в в ЭОК может быть результатом как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистенции, характерной для факторов естественной резистентности [3, 4]. Поэтому, кроме обнаружения ВПЧ рода в, необходимо количественно измерять вирусную нагрузку, определение которой является сравнительно новым подходом в диагностике ВПЧ-инфекции [4]. Фиброэпителиальные полипы (акрохордоны, мягкие фибромы) - распространенная доброкачественная опухоль кожи, клинически манифестирующая в виде кру- глых мягких, эластичных выростов, сжатых у основания, диаметром от 0,5 до 5 мм. Обычно они пигментированы и локализуются на боковой поверхности шеи, в крупных складках, иногда - на лице, спине и груди [5]. Фиброэпителиальные полипы обычно наблюдаются у лиц среднего и пожилого возраста, чаще у женщин, особенно в постменопаузальный период, и у беременных, их число увеличивается с возрастом [5]. Факторами риска развития фиброэпителиальных полипов выступают трение, травмирование кожи (это подтверждает частое появление опухолей в области кожных складок, в местах трения одеждой), а также ожирение и сахарный диабет 2-го типа [5, 6]. Среди иммуносупрессивных пациентов, перенесших трансплантацию почек, фиброэпителиальные полипы выявляют достаточно часто - примерно в трети случаев (у 33 и 37% пациентов по данным зарубежных исследований), с тенденцией к более частому обнаружению при больших сроках иммуносупрессии [6]. Попытки обнаружить ВПЧ при данной патологии предпринимались давно. В 1998 г. C. Dianzani и соавт. [7] при исследовании ДНК ВПЧ 6-го и 11-го типов методом дот-блот гибридизации было обнаружено в 88% фиброэпителиальных полипов (из 49 образцов). В аналогичном исследовании [8] ДНК ВПЧ 6-го и 11-го типов выявили в фиброэпителиальных полипах в 77%, статистически значимо чаще, чем в коже вокруг очагов (53%) и у лиц контрольной группы (20%). В другой работе [9] с участием 50 человек ни в одном образце ткани фиброэпителиальных полипов слизистых типов ВПЧ обнаружить не удалось. Попыток выявить ассоциацию фиброэпителиальных полипов с ВПЧ рода в и изучить вирусную нагрузку в данных очагах ранее не предпринималось. Ранее мы опубликовали [10] наши данные по результатам исследования ВПЧ рода в в тканях при себорейном кератозе, показав наличие значительной вирусной нагрузки как в видимо здоровой коже, так и в очагах себорейного кератоза. Цель исследования - изучить ассоциацию фиброэпителиальных полипов с вирусом папилломы человека на основе количественного анализа ДНК ВПЧ рода в. Задачи исследования: - исследовать встречаемость ДНК ВПЧ рода в в фиброэпителиальных полипах и видимо здоровой коже реципиентов почечного трансплантата (РПТ) и иммунокомпетентных пациентов; - изучить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ рода в в фиброэпителиальных полипах и видимо здоровой коже иммуносупрессивных РПТ и иммунокомпетентных лиц. Материал и методы На базе отделений дерматовенерологии и дерматоонкологии, гемодиализа и трансплантации почки МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского обследовали 52 больных: 22 иммуносупрессивных (8 мужчин и 14 женщин, средний возраст 48 ± 6 лет) и 30 иммунокомпетентных (12 мужчин и 18 женщин, средний возраст 52 ± 11 лет). Длительность иммуносупрессии составила от полугода до 17 лет (медиана 3 года). У каждого из них был проанализирован акрохордон и образец видимо здоровой кожи из области плеча. В качестве группы контроля обследовали 49 здоровых доноров, у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали (табл. 1). В группе контроля были здоровые иммунокомпетентные лица (21 мужчина и 28 женщин, средний возраст 58 ± 14,5 года), у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с ВПЧ, отсутствовали. Большая часть иммуносупрессивных пациентов (18 человек) получала микофенолата мофетил, такролимус и преднизолон, 4 - циклоспорин А в комбинации с другими иммуносупрессивными препаратами. Исследования методом молекулярной генодиагностики ВПЧ-инфекции проводили на базе Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора [10]. Забор материала осуществляли в стерильных условиях борами (микробиоптаты). Исследуемый материал помещали в пробирки с транспортной средой и хранили при температуре -70 оС. Пробоподготовку проводили методом обработки ткани про- теиназой К с последующим выделением методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения ДНК-сорб-С производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. ВПЧ в соскобах определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time), который позволил определить абсолютное количество геномов ВПЧ рода в и ДНК человека в пробе. Амплификацию и детекцию проводили на приборе Rotor-Gene 3000 (“Corbett Research“, Австралия). Для количественного определения ВПЧ рода в использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода а, в, у, ц и п - 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (M. Favre Institut Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, Франция; E.-M. de Villiers, Abteilung tumorvirus-Charakterisierung Referenzzenturum fur Humanpatho- gene Papillomviren, Германия), а также контрольные плазмиды фрагмента в-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для выявления ДНК ВПЧ рода в использовали четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов): 1- я - для выявления генотипов вида в1 (5, 8, 12, 14, 19, 21, 25, 36, 47-й типы); 2- я - для выявления генотипов вида в2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80-й типы); 3- я - для выявления генотипов вида в3 (49, 75, 76-й типы); 4- я - для выявления генотипов вида в4 (92), в5 (96), в1 (20, 24 и 93-й типы). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по в-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля). С учетом того, что при взятии клинического материала из фиброэпителиальных полипов и здоровой кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, использовали методику нормирования количества вируса на количество клеток человека, что позволило получить надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи. Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производили по формуле: ВН = lg [(количество ДНК ВПЧ/количество ДНК человека) х 105]. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Статистическую значимость различий частот определяли с помощью /2-критерия. Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов; сравнение несвязанных выборок осуществляли с использованием критерия Манна- Уитни, связанных - с помощью критерия Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Результаты и обсуждение Полученные данные представлены в виде таблиц. Следует отметить, что у реципиентов почечного трансплантата фиброэпителиальные полипы обнаруживали как на открытых, так и на закрытых участках кожи. Как видно из табл. 2, ВПЧ рода в с высокой частотой выявлялся как в фиброэпителиальных полипах, так и в здоровой коже, что согласуется с ранее полученными данными [10]. ВПЧ чаще обнаруживали в фиброэпителиальных полипах иммуносупрессивных РПТ и иммунокомпетентных лиц (64 и 60% соответственно), чем в образцах видимо здоровой кожи. В целом, РПТ частота обнаружения ВПЧ как в опухолях, так и в видимо здоровой коже была Таблица 4 Встречаемость одного или нескольких видов ВПЧ рода р в образцах эпителиальных опухолей Таблица 3 Сравнительная частота обнаружения разных видов ВПЧ рода р в эпителиальных опухолях и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных пациентов Исследуемые образцы Вид ВПЧ Количество образцов ВПЧ+ ных пациентов Р1* Р2* Р3* Р4,5* Исследуемые образцы Количество ВПЧ в образце абс. % абс. % абс. % абс % абс. один вид два вида РПТ: ВПЧ+ фиброэпителиальные абс. % абс. % 8 57 10 71 4 29 8 57 14 РПТ: полипы видимо здоровая 6 50 8 67 2 17 4 33 12 фиброэпителиальные 14 6 43 8 57 кожа у лиц с ЭОК полипы Иммунокомпетентные: видимо здоровая кожа 12 8 67 4 33 фиброэпителиальные 8 44 10 56 8 44 6 33 18 Иммунокомпетентные: полипы фиброэпителиальные 18 12 67 6 33 видимо здоровая 10 83 4 33 4 33 2 17 12 полипы кожа у лиц с ЭОК видимо здоровая кожа 12 8 67 4 33 Кожа здоровых людей 9 39 8 35 4 17 8 35 23 Кожа здоровых людей 23 17 74 6 26 (контроль) (контроль) Примечание. * - в том числе в ассоциации с другими видами. значимо выше, чем у иммунокомпетентных лиц. Аналогичная ситуация отмечена в отношении других эпителиальных образований кожи в ранее проведенных исследованиях [8]. Как в фиброэпителиальных полипах, так и в здоровой коже выявлен широкий спектр генотипов ВПЧ рода Р, принадлежащих к различным видам (Р1, Р2, Р3, Р4, Р5). В целом, представители различных видов ВПЧ (р1, Р2, р3, Р4, Р5) встречались приблизительно с одинаковой частотой. У иммуносупрессивных РПТ в фиброэпителиальных полипах преобладала ассоциация нескольких видов ВПЧ (в 57% случаев), тогда как у иммунокомпетентных пациентов преимущественно отмечалось инфицирование одним видом ВПЧ (в 67% случаев). В себорейных кератомах иммуносупрессивных пациентов преимущественно зафиксирована ассоциация двух и более видов ВПЧ рода Р. В образцах здоровой кожи иммунокомпетентных лиц без ЭОК отмечалось инфицирование одним видом ВПЧ рода Р (р < 0,05). В остальных случаях частота встречаемости моно- и микстинфекции не различалась. В себорейных кератомах у иммуносупрессивных пациентов вирусная нагрузка была значимо выше, чем в аналогичных опухолях у иммунокомпетентных лиц (медианы 2,8 и 1,8 логарифма на 105 клеток соответственно). Между вирусной нагрузкой в фиброэпителиальных полипах иммуносупрессивных и иммунокомпетентных пациентов значимых различий не выявлено. В здоровой коже иммуносупрессивных лиц (как с ЭОК, так и без них) вирусная нагрузка оказалась значимо выше, чем в здоровой коже иммунокомпетентных лиц (р < 0,03). Также в видимо здоровой коже иммунокомпетентных с ЭОК вирусная нагрузка была значимо большей, чем в здоровой коже у лиц без ЭОК. При попарном сравнении у иммуносупрессивных пациентов вирусная нагрузка в ЭОК (СК и фиброэпителиальных полипах) оказалась значимо большей, чем в здоровой коже. У иммунокомпетентных пациентов вирусная нагрузка в фиброэпителиальных полипах также была выше, чем в здоровой коже (р < 0,05), тогда как между Таблица 5 Медиана логарифма вирусной нагрузки в эпителиальных опухолях и нормальной коже (log ДНК ВПЧ/105 клеток) иммуносупрессивных и иммунокомпетентных пациентов; Me (25%; 75%) Исследуемые образцы Количество элементов Медиана логарифма вирусной нагрузки Иммуносупрессивные: себорейный кератоз 15 2,8 (1,9; 5,4) фиброэпителиальные полипы 6 3,0 (1,9; 4,8) видимо здоровая кожа у лиц с ЭОК 13 1,9 (1,3; 2,3) здоровая кожа у лиц без ЭОК 2 2,45 (1,1; 3,8) Иммунокомпетентные: себорейный кератоз 5 1,8 (1,2; 2,3) фиброэпителиальные полипы 6 3,0 (2,7; 3,2) видимо здоровая кожа у лиц с ЭОК 5 2,3 (1,8; 2,9) здоровая кожа у лиц без ЭОК 23 1,5 (0,9; 1,9) Таблица 6 Выявленная нагрузка различных видов ВПЧ рода р в образцах исследуемой кожи Исследуемые образцы Вид ВПЧ в образце Р1 Р2 Р3 Р4 Иммуносупрессивные: себорейный кератоз 5 3 2 фиброэпителиальные полипы 3 1 1 1 видимо здоровая кожа у лиц с ЭОК 8 3 4 1 здоровая кожа у лиц без ЭОК Иммунокомпетентные: 5 1 себорейный кератоз 3 2 1 фиброэпителиальные полипы 4 1 2 1 видимо здоровая кожа у лиц с ЭОК 5 1 здоровая кожа у лиц без ЭОК 17 4 5 1 7 Таблица 7 Образцы себорейного кератоза и здоровой кожи с выявленным сочетанием различных видов ВПЧ рода в Вид ВПЧ в образце Иммуносупрессивные Иммунокомпетентные себорейный кератоз здоровая кожа себорейный кератоз здоровая кожа Р1 3 3 2 1 Р2 4 4 1 0 Р3 0 0 0 0 Р4 1 1 0 0 р1+2 1 1 0 1 р1+3 0 0 0 0 р1+4 2 2 1 1 р2+3 0 0 0 0 р3+4 0 0 0 0 р2+4 0 0 0 0 Р1+2+3 1 1 0 1 Р1+2+4 0 0 1 1 р2+3+4 0 0 0 0 Р1+3+4 1 1 0 0 Р1+2+3+4 0 0 0 0 Число образцов ВПЧ+ себорейного кератоза с ВПЧ- 3 здоровой кожей, иммуносупрессивных пациентов Число образцов ВПЧ+ себорейного кератоза с ВПЧ- 1 здоровой кожей, иммунокомпетентных пациентов Число образцов ВПЧ- себорейного кератоза с ВПЧ+ 1 здоровой кожей, иммуносупрессивных пациентов Число образцов ВПЧ- себорейного кератоза с ВПЧ+ 0 здоровой кожей, иммунокомпетентных пациентов Рис. 1. Множественные фиброэпителиальные полипы и себорейные кератомы кожи лица у иммуносупрессивного пациента. Рис. 2. Множественные фиброэпителиальные полипы периорби- тальной области у иммуносупрессивного пациента. вирусной нагрузкой в СК и в здоровой коже значимых различий не было. Высокая частота обнаружения ВПЧ, в том числе и в здоровой коже, показанная в зарубежных исследованиях и подтвержденная нами [10], делает возможным более глубокое исследование и определение количественного анализа с определением вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в ВПЧ -положительных (ВПЧ+) образцах фиброэпителиальных полипов и здоровой кожи с нормированием числа ДНК ВПЧ на число клеток (табл. 3, 4). Вирусная нагрузка в фиброэпителиальных полипах и видимо здоровой коже иммуносупрессивных РПТ составила 3 (1,9; 4,8) и 2 (1,3; 2,5) соответственно - данные представлены в виде Me (25%; 75%) (табл. 5). Похожие результаты были получены относительно вирусной нагрузки в фиброэпителиальных полипах и видимо здоровой коже иммунокомпетентных лиц: 3 (2,7; 3,2) и 2,2 (1,6; 2,8) соответственно. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ в здоровой коже доноров была значимо ниже и составила 1,5 (0,9; 1,9), данные представлены в табл. 6, 7. Таким образом, анализ предварительных данных показал, что в фиброэпителиальных полипах и в видимо здоровой коже РПТ ВПЧ рода в обнаруживали с более высокой частотой (64 и 54% соответственно), чем в коже доноров (47%). В фиброэпителиальных полипах у РПТ выявлялось несколько видов ВПЧ рода в: 1, 2, 3 и 4, 5 (57, 71, 29 и 57% соответственно). Рис. 3. Множественные фиброэпителиальные полипы периорби- тальной области у иммунокомпетентного пациента. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Lyubov V. Korneva

Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: lvkorneva@mail.ru
MD, PhD, assistant of Department of Dermato-venerology and Dermato-oncology, Postgraduate Training Faculty Moscow, 129110, Russian Federation

E. S Snarskaya

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, 119991, Russian Federation

E. K Nodelman

Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor of Russia

Moscow, 111123, Russian Federation

References

Supplementary files