Regulatory T cells, CD4+CD25+FOXР3+CD127LOW, in patients with vulgar psoriasis

Full Text

Псориаз – системное воспалительное заболевание, характеризующееся дисрегуляцией иммунотолерантности с последующими гиперпролиферацией кератиноцитов и утолщением эпидермиса [1, 2]. В последние годы при изучении патогенеза данного заболевания ученые уделяют особое внимание роли регуляторных Т-клеток (Трег), а именно субпопуляции CD4⁺CD25⁺Foxр3⁺CD127^LOW. Эти клетки обладают огромным потенциалом в подавлении патологического иммунного ответа, наблюдаемого при различных аутоиммунных заболеваниях, в том числе при вульгарном псориазе (ВП). Трег играют роль противовеса эффекторных Т- и В-лимфоцитов и поддерживают иммунотолерантность. У пациентов с аутоиммунными заболеваниями баланс между эффекторными и регуляторными клетками нарушен. Для того чтобы пролить свет на патогенез аутоиммунных процессов был проведен качественный и количественный анализ Трег-клеток. У большинства пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, например ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, диабетом 1-го типа и рассеянным склерозом, обнаруживается дефект Трег-клеток [3–7]. Существует предположение, что при аутоиммунных заболеваниях возможно как нарушение функциональной активности Трег [8], так и неустойчивость клеток в очаге аутоиммунного воспаления. В дополнение к этому функциональное нарушение иммунного баланса может быть усугублено патогенетическими Т-клетками, которые становятся резистентными к Трег опосредованной супрессии [9].

Дифференциация Трег происходит под контролем транскрипционного фактора FoxP3 – важного элемента супрессивной функции Трег [10, 11]. Снижение функциональной активности Трег коррелирует со снижением уровня FoxP3. Более того, иммунодефицитный IPEX-синдром (Х-сцепленный синдром иммунной дисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии), рассматриваемый в рамках аутоиммунного процесса, обусловлен мутацией гена FoxP3 [12]. «Неисправность» FoxP3 приводит к остро протекающему воспалительному процессу как в исследованиях с использованием животных моделей (у мышей), так и у людей [10].

Специфическими для регуляторных Т-клеток маркерами являются CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^low. Трег экспрессируют низкий уровень рецептора к IL-7 (CD127) на поверхности клетки [13, 14]. В то же время экспрессия CD127 обратно коррелирует с экспрессией FoxP3 и супрессивной активностью CD25^high Tрег [15]. Нативные (нТрег) CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ зарождаются в тимусе, тогда как индуцированные Трег могут образовываться в периферической крови из циркулирующих CD4⁺CD25^lowFoxP3^- T-клеток [16].

В ходе нескольких исследований на мышиных моделях была продемонстрирована способность Трег ингибировать как запуск, так и прогрессирование уже некоторое время протекающего аутоиммунного процесса [17–21]. Например, выращенные ex vivo CD4⁺CD25⁺ T-клетки (eTregs) обладают выраженной in vitro супрессивной способностью даже в присутствии параллельно выращенных ex vivo эффекторных Т-клеток.

В ряде исследований продемонстрирована эффективность адоптивной терапии с использованием нТрег для лечения различных аутоиммунных заболеваний [19]. A. Kohm и соавт. [18] продемонстрировали роль Трег в ингибировании обострения экспериментального аутоиммунного энцефало- миелита у мышей типа C57BL/6 с использованием MOG35–55-специфической мышиной модели рассеянного склероза.

Отдельным вопросом является зависимость стадий течения ВП от уровня Трег-клеток в периферической крови. Ранее В.Р. Хайрутдинов и соавт. [22] продемонстрировали более высокие показатели Трег-клеток в периферической крови больных псориазом в прогрессирующей стадии по сравнению со здоровыми донорами. При этом и в стадии ремиссии у больных ВП показатели Трег-клеток были выше, чем у здоровых доноров, а значимой разницы между уровнем Трег в прогрессирующей стадии и в период ремиссии не наблюдалось. Также было установлено, что количество мРНК FOXP3⁺ в очагах высыпаний при прогрессирующей стадии ВП в 10 раз больше, чем в коже здоровых доноров.

В ходе исследования было показано, что Трег-клетки реагируют на медикаментозную терапию псориаза, а продолжительная ремиссия связана со стабилизацией Трег-клеток и наступлением баланса между патогенетическими клетками-памяти и эффекторными клетками [23]. По окончании терапии моноклональными антителами (инфликсимаб, этанерцепт, эфализумаб) у больных псориазом наблюдается повышение содержания CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺-клеток как в крови, так и в коже. Такие же данные были продемонстрированы и при лечении адали-мумабом [23–26]. P. Quaglino и соавт. [26] выявили, что терапия этанерцертом способствует подавлению избыточной супрессорной активности Th1/Th17 по отношению к Трег-клеткам. На стимуляцию активности Трег-клеток могут влиять анти-TNF механизмы [23]. Так, алефацепт ингибирует эффекторные Т-клетки (Тэфф) путем апоптоза Т-клеток за счет высвобождения гранзимов NK-клетками. Апоптоз запускается под действием Трег-клеток и в свою очередь приводит к ремиссии [25]. T. Furuhashi и соавт. [27] оценили уровень Трег-клеток в крови больных псориазом до и после фототерапии. Исходно пациенты с индексом распространенности и тяжести псориаза (PASI, Psoriasis Area and Severity Index) 90 имели в крови гораздо большее количество Трег-клеток, чем пациенты с меньшим PASI. Было показано, что УФБ-терапия способна индуцировать продукцию Трег-клеток [24]. К схожему заключению пришли и R. Kubo и соавт. [28], доказавшие, что ПУВА-терапия (от англ. psoralen and ultraviolet A ― псорален и длинноволновое ультрафиолетовое излучение) существенно повышает количество Трег-клеток в крови и возвращает функциональную активность Трег-клеток в нормальное состояние у больных псориазом. Разница в количестве Трег-клеток у пациентов при получении различных видов терапии может объяснить, почему при некоторых подходах к лечению (метотрексат или циклоспорин) ремиссия непродолжительная, а при других (алефацепт и УФБ) – более продолжительная [24]. И, что более важно, определение значений Трег-клеток может помочь спрогнозировать эффективность терапии [23–28]. I. Kotb и соавт. [29] провели сравнительную оценку эффективности регулирования уровня Трег клеток у больных псориазом на фоне разных терапевтических методик, а именно фототерапии УФБ-311 нм, адалимумабом и локальным применением комбинации бетамезона и кальципотриола. По результатам проточной цитометрии в первом случае отмечался рост числа Трег-клеток как в периферической крови, так и в псориатических очагах. При приеме адалимумаба число Трег оставалось неизменным, а положительная динамика клинической картины объяснялась снижением содержания Th17. На фоне местной терапии отмечалось как снижение показателей Th17, так и повышение значений Трег.

C. Mattozzi и соавт. [30] описали взаимосвязь между витамином D и Трег-клетками при псориазе. Целью исследования было выявление корреляции между циркулирующими в крови Трег-клетками и PASI. Было продемонстрировано, что низкий титр индуцирует активность Th1, Th17 и Th22, а свою способность влиять на иммунные реакции витамин D частично реализует благодаря своему воздействию на Трег-клетки.

Материал и методы

В исследование были включены 60 больных ВП (35 женщин и 25 мужчин) в возрасте от 18 до 55 лет, наблюдавшихся в Клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова Сеченовского Университета. У 28 больных диагностирована прогрессирующая, у 19 стационарная, у 13 регрессирующая стадия ВП. Критерием исключения являлось наличие у обследуемых больных псориатической эритродермии, псориатического артрита; аутоиммунных заболеваний, кроме ВП; лечение системными глюкокортикостероидами в течение последнего месяца, а также лечение иммуносупрессивными препаратами (азатиоприн, метотрексат) и иммуноглобулинами и/или моноклональными антителами в анамнезе. Для определения степени тяжести для каждого пациента высчитывали индекс PASI: у 10 больных – 13,57 ± 4,32%, что соответствовало легкой степени тяжести, у 22 – 26,42 ± 2,73% (средняя степень тяжести), у 28 – 41,41 ± 8,11% (тяжелое течение ВП). Все пациенты были разделены на две группы в зависимости от длительности заболевания: менее 20 лет – 42, 20 лет и более – 28.

В качестве контрольной группы были обследованы 42 здоровых донора, соответствующих больным основной группы по возрасту.

Поскольку в последние годы идут дискуссии о возможности применения цитометрического анализа содержания Трег для оценки эффективности терапевтического потенциала тех или иных методик, мы решили наглядно продемонстрировать, как с помощью изучения уровня Трег можно определить эффективность фототерапии ВП. В исследовании приняли участие 12 пациентов с прогрессирующей стадией ВП, у которых изучали уровень Трег в периферической крови до и после курса УФБ-311 нм, состоящего из 15–20 процедур. Всем больным определяли содержание субпопуляции Трег CD4⁺CD25⁺Foxр3⁺CD127^LOW. Для этого периферическую кровь (5–10 мл) больных ВП и здоровых доноров набирали в пробирки с антикоа-гулянтом K₃ЭДТА. Окрашивание лимфоцитов соответствующими антителами проводили с помощью набора реагентов для иммунофенотипирования 7-Color Immunophenotyping Kit, Human (Miltenyi Biotec, Германия). Цитометрический анализ Трег лимфоцитов CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺CD127^LOW проводили на проточном цитометре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия).

Для статистической обработки использовали программу Statsoft Statistica 8.0. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты

В крови всех обследованных больных ВП коли- чество Трег-клеток CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺CD127^LOW было снижено относительно здоровых лиц: Трег в периферической крови больных ВП составило 2,84 ± 1,00%, у здоровых доноров – 4,02 ± 0,73%. В то же время было установлено, что у больных ВП на разных стадиях заболевания (прогрессирующей, стационарной, регрессирующей) количество Трег возрастало по мере регрессирования процесса – 2,59 ± 0,68 и 2,82 ± 1,55% в прогрессирующей и стационарной стадии соответственно (р = 0,001). Максимальное количество Трег наблюдалось в регрессирующей стадии – 3,68 ± 1,62%.

Также в ходе исследования нами было сопоставлено количество Трег у больных с разной продолжительностью заболевания. Выявлено, что количество Трег обратно пропорционально длительности процесса. У группы пациентов, страдающих ВП менее 20 лет, показатель составил 3,42 ± 1,11%, а у болеющих 20 лет и более – 2,31 ± 0,62%. Таким образом, определялась обратная корреляционная зависимость (r = -0,46) между количеством Трег в периферической крови и длительностью заболевания: чем дольше анамнез ВП, тем ниже показатели Трег.

Также нами была обнаружена обратная корреляция между количеством субпопуляции Трег CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺CD127^LOW и степенью тяжести ВП, которую оценивали с помощью индекса PASI (r = -0,39): чем тяжелее процесс, тем ниже показатели Трег в периферической крови пациентов.

По окончании курса фототерапии УФБ-311 нм у 12 пациентов отмечался статистически значимый прирост содержания Трег (2,11 ± 0,61% – до начала терапии и 3,43 ± 1,02% – после курса терапии).

Обсуждение

В ходе исследования обнаружено, что количество Трег в крови больных ВП не превышает количество Трег в крови здоровых доноров, что не подтверждает ранее полученные результаты отечественных ученых [22]. Вместе с тем в проведенном исследовании нами было установлено, что количество Трег в периферической крови больных ВП постепенно нарастает при переходе прогрессирующей стадии в стационарную и затем в регрессирующую. Эти данные подтверждают ранее выдвинутую теорию иностранных авторов о влиянии Трег на стадийность ВП [31].

Продемонстрированная нами обратная корреляция между длительностью заболевания и количеством Трег, содержащихся в периферической крови больных ВП, также находит свое подтверждение в исследованиях патогенеза других аутоиммунных заболеваний [32]. По-видимому, это обусловлено длительно существующим аутоиммунным процессом, вызывающим истощение регуляторных механизмов у больных. Выявленная в работе обратная корреляция между количеством Трег у больных ВП и тяжестью клинической картины является следствием активации аутоиммунного процесса. Определена возможность применения цитометрического анализа в качестве критерия оценки эффективности терапии на примере пациентов ВП, прошедших курс УФБ-311 нм, что согласуется с ранее проведенным исследованием I. Kotb и соавт. [29].

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о ключевой роли Трег в патогенезе ВП и служат предпосылкой к созданию иммунных вакцин на основании аутологичных Трег в качестве возможного эффективного терапевтического метода, позволяющего целенаправленно и точечно ингибировать аутоиммунное воспаление и минимизировать риск появления побочных эффектов.

About the authors

O. Yu. Olisova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Author for correspondence.
Email: lakmus1991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2482-1754

Department of Dermatology and Venereology

Russian Federation, 119991, Moscow

S. N. Bykovskaia

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: lakmus1991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9958-7750

Department of Cell Technologies and Tissue Regeneration 

Russian Federation, 117997, Moscow,

V. V. Gudova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: lakmus1991@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1141-7437

postgraduate student of Department of Dermatology and Venereology

Russian Federation, 119991, Moscow

References

Supplementary files