EXPRESSION OF NUCLEAR MATRIX METALLOPROTEINASE-2 IN PATIENTS WITH CUTANEOUS MELANOMA DEPENDING ON THE AVAILABILITY OF MUTATIONS IN THE PPP6C GENES

Full Text

Исследование генетического портрета опухоли любого гистогенеза представляет собой перспективное направление в области молекулярной онкологии, принципиально меняющее дальнейший подход к терапии онкологических заболеваний. Исследования полногеномного секвенирования образцов ткани меланомы кожи, проводимые в последние годы, выявили, что преобладающим типом мутаций при поверхностно распространяющейся и узловой формах данной опухоли являются мутации в генах BRAF и NRAS; для меланом с локализацией в области ладоней, подошв,и на слизистых оболочках более характерными являются мутации в гене c-KIT [1]. Позднее были идентифицированы новые гены, мутации в которых встречаются при меланоме кожи, в частности гены PPP6C и RAC [2]. Все вышеуказанное послужило поводом к формированию подтипов меланом в соответствии с мутационным профилем опухоли, среди которых выделяют отдельно BRAF/NRAS-негативные меланомы, характеризующиеся высокой мутационной нагрузкой, наличием однотипных нуклеотидных замен, а именно заменой C>T (цитозина на тимин), дупликациями нуклеотидов, а также возможным наличием мутаций в генах с-KIT и NF1 [3]. Позднее был выделен ещё один молекулярно-генетический подтип, а именно NRAS/BRAF/NF1-негативные меланомы [4]. Кроме того были идентифицированы гены, часто встречающиеся в сочетании (ассоциированные) с основными драйверными мутациями при меланоме кожи. К генам, ассоциированным с BRAF-мутацией, были отнесены гены TP53 и COL1A1, а к генам, ассоциированным с NRAS-мутацией, были отнесены такие гены как: PPP6C, KALRN, PIK3R4, TRPM6, GUCY2C и PRKAA2 [5]. Исследование ассоциаций гена серин треониновой фосфатазы 6 (PPP6C) с драйверными мутациями является актуальным, поскольку считается, что совместно возникающие мутации могут изменять чувствительность к таргетной терапии BRAF-позитивных меланом [6]. Позднее было выявлено, что появление мутаций в данном гене может сочетаться с наличием у пациентов мутаций не только в гене NRAS, как считалось ранее, но и в гене BRAF [7]. Ген PPP6C кодирует каталитическую субъединицу PP6 серин треонинфосфатазного комплекса и специфически связывается с тремя регуляторными белками: PP6R1, PP6R2 и PP6R3 [8]. Данные о функциональной роли данного белка весьма противоречивы: в одних работах показано, что мутации в гене PPP6С приводят к потере активности данного белка и наличие мутаций в данном гене может рассматриваться в качестве драйверной мутации при меланоме кожи [9]. Другими авторами выявлено, что даже специфичные для меланомы мутации, в том числе мутации в гене PPP6C могут быть лишь «мутациями-пассажирами» и не нести никаких функциональных последствий [10]. При этом является актуальным вопрос, обладает ли опухоль, имеющая мутацию в данном гене, особыми биологическими свойствами. ММП-2 (матриксная металлопротеиназа-2) представляет собой фермент семейства эндопептидаз, принимающий участие в таких процессах как клеточная пролиферация, апоптоз, ангиогенез [11]. При этом данный фермент рассматривается в качестве прогностического маркера при ряде онкологических заболеваний [12]. Показано, что повышение уровня ММП-2 при меланоме кожи приводит к увеличению инвазивной способности опухолевых клеток, а также способствует ремоделированию компонентов внеклеточного матрикса, данные эффекты становятся более выраженными в условия применения BRAF-ингибиторов, в частности вемурафениба [13]. Кроме того в проводимых ранее исследованиях, увеличение экспрессии ММП-2 было ассоциировано с увеличение количества микрососудов в ткани при меланоме кожи [14]. Взаимосвязь изменений уровня экспрессии ММП-2, а также биологических свойств BRAF-позитивных опухолей, позволяет думать о возможной связи экспрессии ММП-2 и с другими BRAF-ассоциированными мутациями, в частности мутациями в гене PPP6C. Цель исследования - оценить экспрессию ядерной ММП-2 у больных меланомой кожи в зависимости от наличия у них мутаций в гене PPP6C для определения особенностей биологического поведения меланомы кожи с наличием вышеуказанной мутации. Материалы и методы Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО КрасГМУ, протокол №52/2013 от 27.11.2013). Биоптаты больных меланомой кожи были получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Перед выделением ДНК стекла пациентов, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на содержание опухолевых клеток в срезе, отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток 60% и более. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора ДНК-сорб В (“AmpliSens”, Россия). На первом этапе работы проводили анализ мутации BRAF-V600E методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ). На следующем этапе исследования проанализировано наличие мутаций в 3-м экзоне гена NRAS методом секвенирования по Сэнгеру. В дальнейшем были отобраны 40 больных, имеющие мутации в генах BRAF или NRAS, у которых определялось наличие мутаций в 7-м экзоне гена PPP6C. Затем проводили постановку реакции амплификации ПЦР, для приготовления ПЦР-смеси использовали набор Encyclo Plus PCR kit («Евроген», РФ), ПЦР-смесь готовили в количестве 25 мкл в расчёте на 1 реакцию. Состав ПЦР-смеси включал следующие компоненты: 10X Encyclo буфер 2,5 мкл; стерильная вода для ПЦР; 50x DNTP 0,5 мкл; PCR-праймер (прямой) и PCR-праймер (обратный) по 1 мкл; ДНК матрица 2,5 мкл; 50X Encyclo полимераза. Использовалась следующая последовательность праймеров к фрагменту гена PPP6C (7-й экзон): forward 5’-ACAGTGCCTTTCTAAATTGC-3’; reverse 5’-GGAATAACACGTTCTGAATCTG-3’. Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация 95оС 3 мин, далее денатурация 95оС 15 с, отжиг 57оС 40 с, элонгация 72оС 40 с, всего 35 циклов, в завершении финальная элонгация 72оС 3 мин. Для подтверждения эффективности ПЦР проводили электрофоретическое разделение молекул в 2% агарозном геле при напряжении 90 В в течение 40 мин, с последующей окраской геля в растворе бромистого этидия с финальной концентрацией раствора 0,2 мкг/мл. После чего производили визуализацию геля на системе визуализации ChemiDoc™MP (“Bio-Rad”, США). Результат реакции считали положительным, если на геле чётко были видны светящиеся полосы, соответствующие молекулярной массе ампликона 239 п.н. На следующем этапе исследования проводили выделение концентрированных образцов двухцепочной ДНК из реакционной смеси, при помощи набора Cleanup Mini («Евроген», Россия). После чего повторно осуществляли электрофорез в 2% агарозном геле с целью выяснения количества концентрированного ПЦР-продукта по интенсивности свечения полос. Для постановки одной реакции секвенирования использовалось 10 мкл раствора, содержащего очищенный целевой продукт с концентрацией 20-50 нг/мкл. Секвенирование проводилось методом Сэнгера с последующим анализом хроматограмм в программе Sequence scanner 1,0 (“Applied Biosystems”, США). В дальнейшем проводилия анализ взаимосвязи между наличием мутации в гене PPP6C и клинико-морфологическими параметрами заболевания: пол, возраст, локализация опухоли, толщина опухоли по Бреслоу, уровень инвазии по Кларку, интенсивность лимфоцитарной инфильтрации опухоли, клинико-морфологическая форма заболевания, гистологический подтип опухоли, выраженность пигментации опухоли, наличие изъязвления опухоли, стадия меланомы по AJCC. Исследование экспрессии MMП-2 осуществляли с помощью иммуногистохимического метода по стандартному протоколу c использованием безбиотиновой системы детекции REVEAL Biotin-Free Polyvalent (Spring, “BioScience”, США) с использование мышиных поликлональных антител (Spring, “BioScience”, США) в разведении 1:100. Для визуализации продукта реакции применяли AEC (амино-этил-корбазол) (“Sigma”, США) в качестве хромогена. Контр-окрашивание ядер осуществляли с помощью гематоксилина Майера. Подсчёт положительно окрашенных клеток проводили при увеличении 600 с помощью микроскопа Olympus BX-41, программа Infinity Capture, камера (“Lumenera Corporation”) и software V.4.6.0. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле: S = 1a + 2b + 3c, где а - % слабо окрашенных ядер клеток; b - % умеренно окрашенных ядер клеток; с - % сильно окрашенных ядер клеток. Степень выраженности экспрессии расценивали: 0-10 баллов - отсутствие экспрессии, 11-100 - слабая экспрессия, 101-200 - умеренная экспрессия, 201-300 - выраженная экспрессия. Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7,0; проверку нормальности распределения выборки - с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Статистическую значимость различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. Различия признавали статистически значимыми при р < 0,05. Результаты Методом прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру были изучены соматические немолчащие протеин-кодирующие мутации в образцах меланомы кожи (рис. 1). Мутации в гене PPP6C были выявлены у 5 (12,5%) пациентов, при этом в 80% случаев мутации были взаимоисключающими, т.е. в генотипе опухоли встречалась только одна единственная мутация и сочетания мутаций с известными вышеуказанными драйверными мутациями в генах BRAF, NRAS не наблюдалось. У 35 (87,5%) пациентов была определена опухоль «дикого» типа. Синонимические замены в нуклеотидах были обнаружены в позициях 265, 269, 270, 271. У всех пациентов, имеющих мутации в данном гене, наблюдались миссенс-мутации: G266R (у 1 пациента), I271N (у 2 пациентов), P259H (у 1 пациента), у одного пациента было выявлено сочетание двух мутаций в «горячих точках» гена, одна в 259-м кодоне P259L (c. 776C > T) и вторая в 264-м кодоне, R264L (c.791C > T). Не было выявлено взаимосвязи между клинико-морфологическими признаками заболевания и наличием мутаций в гене PPP6C (см. таблицу). Экспрессия ядерной ММП-2 среди пациентов, имеющих данную мутацию и пациентов, не имеющих данной мутации, не различалась (p > 0,72). Так, ИГХ-коэффициент для PPP6C мутантных образцов составил 30,2±8,89; а для оьразцов PPP6C дикого типа он составил 25,4±5,26. Преимущественная экспрессия ядерной ММП-2 наблюдалась у PPP6C-негативных пациентов. Более того, у пациентов, имеющих мутации в гене PPP6C, регистрировалась преимущественно цитоплазматическая экспрессия ММП-2 (p = 0,045). Обсуждение По данным литературы [15], наличие мутаций в гене PPP6C у пациентов с первичной меланомой позволяет рассматривать данный вид мутаций как раннее событие в меланоме кожи. Известно, что мутации в гене PPP6C не ассоциированы с какими-либо клинико-морфологическими показателями заболевания, кроме как толщина опухоли по Бреслоу [16]. Также было показано, что прогностическое значение для пациента имеет характер мутаций: более неблагоприятный для пациента прогноз связан с наличием нонсенс-мутаций по сравнению с миссенс-мутациями. Данные мутации приводят к образованию стоп-кодона и ассоциированы с ранним появлением у больных меланомой кожи висцеральных метастазов, а также низкой выживаемостью пациентов [7]. Кластеризация мутаций в гене PPP6C, в частности, высокая повторяемость точечной мутаций R264C, позволяют думать о её активизирующей роли и возможности выступления данной мутации в роли онкогена [9]. Биологическая роль различного вида мутаций в данном гене заключается в том, что они дестабилизируют голоэнзим PP6C и приводят к усилению активности киназы Aurora-A, что в свою очередь влияет на эффективность хромосомной конгрессии и сегрегации, что в итоге приводит к хромосомной нестабильности, которая также способствует микронуклеации из-за дефектной сегрегации хромосом [17]. Наличие ядерной экспрессии ММП-2 рассматривается как прогностически неблагоприятный признак среди пациентов, ассоциированный с ранним метастазированием и наибольшими размерами опухолевого узла [18]. Кроме того считается, что функциональная роль ядерной и цитоплазматической ММП-2 тоже могут различаться. В отдельных тканях организма цитоплазматическая экспрессия ММП-2 присуща исключительно нормальной ткани организма, появление же ядерной экспрессии наблюдается исключительно в опухолевой ткани [19]. Таким, образом, мы не выявили ассоциации между таким неблагоприятным признаком как ядерная экспрессия ММП-2 и наличием мутаций в гене PPP6C, однако следует отметить, что в реализацию таких свойств опухоли как инвазивность, способность к метастазированию оказывают влияние множество факторов и биологически активных веществ. Основная роль цитоплазматической ММП-2 сосредоточена на процессе ангиогенеза в опухоли [20]. Цитоплазматическая локализация в PPP6C-мутантных опухолях может быть связана с тем, что в условиях возникновения данной мутации, могут реализовываться другие, в частности антиангиогенные механизмы. Известно, что продукция матриксных металлопротеиназ происходит при активации NF-каппа-B-сигнального механизма, который в свою очередь может вовлекаться при наличии мутационного процесса в гене PPP6C. На рис. 2 схематично показано появление мутации в гене PPP6C, приводящее к хромосомной нестабильности в сочетании с микронуклеацией ядра. На первом этапе УФ-лучи воздействуют на кожу пациента, приводя к повреждению ДНК во множестве локусов, а также к появлению мутаций в гене PPP6C, что, в свою очередь, вызывает потерю каталитической активности PP6C, а также снижение стабильности белка. Таким образом, данные клетки войдут в митоз с повышенной Auro-A киназной активностью. В конечном итоге это может вызывать нарушение формирования веретена деления и микронуклеации из-за дефектной сегрегации хромосом. Формирование микроядер способствует нарушению в них репликации ДНК из-за сниженного в них количества ядерных пор и структурных дефектов в ядерной оболочке [21]. Поэтому данные клетки будут входить в митоз с недореплицированными микроядерными ДНК, что приводит к фрагментации хромосом [22]. В результате мутаций в гене PPP6C наблюдается потеря клетками PP6-активности, которая способствует хромотрипсису ядра (одномоментному появлению большого числа хромосомных перестроек) в клетках и дальнейшей инициации процесса канцерогенеза через накопление микроядер с повышенной Auro-A киназной активностью. В литературе описана роль PPP6C в процессе клеточного деления, так данный ген участвует в качестве регулятора мейоза ооцитов и фертильности у женщин, дефицит данного фермента приводит к аномальному расхождению хромосом в мейозе (II) и нарушению цитокинеза, что приводит к появлению зигот с высоким риском анеуплоидии и дефектов раннего эмбрионального развития [23]. Несмотря на то, что мутации в гене PPP6C встречаются всего в 10% случаев среди всех меланом, данные некоторых исследований показывают, что вследствие опухолевой гетерогенности, мутантные клетки могут быть обнаружены в опухоли наряду с клетками «дикого» типа [24]. Следует также отметить, что довольно часто мутации в гене PPP6C встречаются в BRAF-негативных меланомах. До недавнего времени данная группа пациентов рассматривалась как группа пациентов с ограниченными химиотерапевтическими возможностями, что делает перспективным подобного рода исследования.

About the authors

Maria B. Aksenenko

Department of Pathophysiology, Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
MD, PhD, docente, Department of Pathophysiology with a Course of a Clinical Pathophysiology, Krasnoyarsk State Medical University of prof. V.F. VoynoYasenetsky, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

T. G Ruksha

Department of Pathophysiology, Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files