EKSPRESSIYa GENA TOLL-PODOBNOGO RETsEPTORA 7-GO TIPA V KOZhE BOL'NYKh PUZYRChATKOY

Abstract

Full Text

Пузырчатка - тяжелый буллезный дерматоз, характеризующийся поражением кожи и/или слизистых оболочек, ведущую роль в патогенезе которого отводят аутоиммунным реакциям, приводящим к акантолизу. Провоцирующими факторами развития пузырчатки чаще всего являются стрессы, инфекционные заболевания, а также применение лекарственных препаратов, вакцин, избыточная инсоляция [Давиденко Е.Б., Махнева Н.В., 2012; Esmaili N. и соавт., 2013; Ruоccо V. и соавт., 2013; Yoshimura K., 2014]. Описаны случаи развития симптомов пузырчатки у лиц при медикаментозной стимуляции Toll-подобного рецептора 7-го типа (TLR7) [Schiavo A. и соавт., 2008; Bauza A. и соавт., 2009; Sebaratnam D. и соавт., 2011], что указывает на его возможную роль в патогенезе данного заболевания [Sebaratnam D. и соавт., 2011]. Однако изучение рецепторов врожденного иммунитета у больных пузырчаткой не проводилось. Цель исследования - изучить уровень экспрессии гена TLR7 в коже больных пузырчаткой. Материал и методы. Для изучения экспрессии гена TLR7 исследованы биоптаты кожи 38 больных пузырчаткой (биопсировали участки видимо не пораженной кожи) и 24 здоровых людей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Суммарную РНК у больных пузырчаткой и здоровых людей выделяли с помощью набора Rnеasy Mini Kit (“QIAGEN”, Германия) согласно протоколу производителя. Предварительно образцы кожи были подвергнуты гомогенизации на гомогенизаторе Tissue Lyser (“QIAGEN”, Германия) в буфере с b-меркаптоэтанолом. Осадок РНК растворяли в воде, отбирали аликвоту и определяли концентрацию водного раствора РНК на биофотометре Eppendorf (Германия). Хранили раствор РНК при -20 °С. Синтез кДНК с использованием в качестве матрицы РНК, выделенной из изучаемых образцов, проводили с помощью коммерческого набора для постановки обратной транскрипции ОТ-ПЦР («Силекс», Россия). ПЦР-РВ проводили на приборе LightCycler 480 (“Rоche”, Швейцария) с использованием линейных разрушаемых зондов, меченных флюорофором и гасителем флюоресценции (TaqMan). Для амплификации исследуемых генов использовали наборы с HS Taq-полимеразой в соответствии с инструкцией производителя. Для осуществления постановки ПЦР-РВ были подобраны специфические праймеры и зонды. Применяли оптимизированные для метода ПЦР-РВ пары праймеров QuantiTect Primer Assay (“Qiagen”, США). В качестве внутреннего стандарта использовали «нормировочные» гены, относительно которых производили расчет экспрессии TLR7 (гены «домашнего хозяйства» - housekeeping genes - β-актин и PANK), экспрессия которых считается стабильной для человека. Последовательности праймеров TLR7 и генов «домашнего хозяйства» (β-актин и PANK) подбирали в программе Оligо 6,0. При анализе результатов амплификации использовали метод прямого сравнения графиков накопления продуктов реакции ПЦР-РВ по максимуму 2-й производной, предлагаемый разработчиком программного обеспечения. Полученные данные оценивали по значению Cp (crossing pоint) - значению цикла реакции, характеризующему кривую графика амплификации. Количество исследуемых кДНК, полученных из РНК путем обратной транскрипции, в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР-РВ. Для определения экспрессии каждого гена ПЦР-РВ проводили в трех повторностях, после чего рассчитывали среднее значение экспрессии гена. Уровень экспрессии генов TLR7, β-актин, PANK оценивали в условных относительных единицах (ОЕ) экспрессии с расчетом М - среднего значения; m - ошибки среднего значения. Проводили нормирование общего количества РНК в образцах, которое позволило нивелировать различия в количестве и/или качестве стартового материала, а также в условиях пробоподготовки. Результаты. При расчете экспрессии гена TLR7 по отношению к нормировочному гену β-актин у больных пузырчаткой был выявлен статистически значимый более высокий уровень экспрессии TLR7 (249,95 ± 21,89 ОЕ), чем у здоровых людей (186,13 ± 17,76 ОЕ; р < 0,05). Экспрессия TLR7 по отношению к гену PANK была также статистически значимо выше у больных пузырчаткой (2,96 ± 0,34 ОЕ), чем у здоровых людей (1,61 ± 0,23 ОЕ; р < 0,05). В результате выполнения исследований методом ПЦР-РВ показано, что уровень экспрессии гена TLR7 в коже больных пузырчаткой, выраженный в условных относительных единицах (по отношению к нормировочному гену β-актин - 249,95 ± 21,89 ОЕ; по отношению к нормировочному гену PANK - 2,96 ± 0,34 ОЕ), значительно превышал экспрессию этого гена у здоровых лиц (186,13 ± 17,76 ОЕ и 1,61 ± 0,23 ОЕ соответственно; р < 0,05). Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о повышении транскрипционной активности генома больных пузырчаткой и активации сигнальных путей TLR7 в клетках. Высокие концентрации TLR7 в эпителиоцитах могут приводить к нарушению эффективной работы иммунной системы, так как усиливают синтез провоспалительных цитокинов. Это приводит к увеличению выработки аутоантител и активации процессов акантолиза, что является дополнением существующих представлений о механизмах развития пузырчатки и может быть использовано для разработки новых методов терапии больных, а также диагностики пузырчатки.