DECREASE OF MIGRATION ACTIVITY AND PROLIFERATION OF BRO MELANOMA CELLS BY MIR-4286 INHIBITION

Full Text

Меланома кожи является опухолью, характеризующейся высокой степенью гетерогенности и быстрым развитием метастазирования. Среди лиц со светлой кожей частота меланомы ежегодно увеличивается [1]. На ранней стадии меланома излечима, но прогноз пациентов с метастатической меланомой неблагоприятен [2, 3]. Для своевременной диагностики меланомы используются массовые скриниговые исследования, эффективность которых не всегда высока [1]. Становится ясным, что использование современных методов диагностики, в том числе и генетических исследований, у лиц с выявленной предрасположенностью к меланоме является наиболее правильным подходом к снижению смертности и увеличению продолжительности жизни при этом заболевании [4]. Следовательно, необходимы поиск новых диагностических и терапевтических мишеней меланомы и исследования молекулярных механизмов развития данного новообразования. К числу регуляторов экспрессии онкогенов и онкосупрессоров относятся микроРНК. МикроРНК - это класс малых некодирующих молекул, состоящих приблизительно из 22 нуклеотидов, которые играют фундаментальную роль в посттранскрипционной регуляции генов [5, 6]. На сегодняшний день известно несколько тысяч различных микроРНК. Одним из механизмов действия микроРНК является их связывание с комплементарными участками в 3′-нетранслируемой области мРНК, что индуцирует ее деградацию и снижает экспрессию данной мРНК [7]. Изменение экспрессии микроРНК показано при ряде дерматологических заболеваний. Например, повышение уровня микроРНК-155 выявлено при атопическом дерматите [8]; аберрантная экспрессия микроРНК-203, 146а, 21 - при псориазе [9]. Установлено, что экспрессия микроРНК-4286 в ткани меланомы статистически значимо выше, чем в ткани невусов [10]. Экспрессионный профиль микроРНК характеризуется высокой тканеспецифичностью. МикроРНК обладают высокой стабильностью в биологических образцах [11]. Таким образом, данные молекулы являются перспективными мишенями для диагностики и таргетной терапии злокачественных новообразований. Цель исследования - оценить отдельные аспекты функциональной роли микроРНК-4286 при меланоме кожи. Материал и методы Биоинформационный анализ сигнальных путей для микроРНК-4286 проводили с помощью базы DIANA miRPath v.3.0. (с использованием трех баз данных TargetScan v.7.0, microT-CDS v.5.0 и TarBase v.7.0). Поиск сигнальных путей был произведен на базе веб-ресурса KEGG (Киотская классификация генов и геномов). Культивирование клеток и трансфекция ингибитора микроРНК Исследование выполнено на базе кафедры патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого». Утверждено локальным этическим комитетом (протокол №59 от 02.12.14). Для исследования использовали клеточную культуру меланомы линии BRO, любезно предоставленную ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (НИИФКИ, Новосибирск). Клетки меланомы BRO культивировали в питательной среде RPMI Medium 1640 с L-глутамином c добавлением фетальной бычьей сыворотки Fetal Bovine Serum. Культивирирование проводили в СО-инкубаторе при содержании углекислого газа 5% и температуре 37 °С. Для оценки влияния микроРНК-4286 на миграцию клеток меланомы проводили так называемый скрэтч-тест. Для этого предварительно осуществляли трансфекцию специфического ингибитора микроРНК-4286 (Ambion, “Life Technologies”, США), негативного контроля - anti-miR negative control (Ambion, “Life Technologies”, США) в 24-луночном планшете при концентрации клеток 1 × 10 клеток/мл по протоколу производителя, используя в качестве трансфектанта Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen, “Life Technologies”, США). Эффективность трансфекции подтверждали стандартным методом по экспрессионному уровню мРНК белка HMGA2 (хроматинсвязанный негистоновый белок) (“Applied Biosystems”, США), поскольку данный белок является мишенью для положительного контроля - miR-let-7c [12]. Анализ миграционной активности (scratch-test, анализ на зарастание «раны») После осуществления трансфекции ингибитора микроРНК-4286 клеточную культуру культивировали до достижения плотности покрытия 80%. Затем пластиковым наконечником наносили «царапины» в лунках с клеточной культурой и после дважды промывали в фосфатно-солевом растворе. Далее производили смену питательной среды с 1% содержанием FBS (Fetal Bovine Serum) (Gibco, “Life Technologies”, США). Визуализацию осуществляли на инвертированном микроскопе (ЛОМО, Россия) с использованием камеры Infinity 1.0 (“Lumenera Corporation”, Канада) сразу после проведения царапины, через 12 и 24 ч в одних и тех же участках с помощью программного обеспечения Infinity Analyze Release 6.5 (“Lumenera Corporation”, Канада). Скорость миграции клеток оценивали по изменению площади царапины при помощи программы Infinity Analyze Release 6.5 (“Lumenera Corporation”, Канада). Клеточный цикл Для оценки влияния микроРНК-4286 на клеточный цикл меланомы BRO предварительно проводили трансфекцию ингибиторов микроРНК-4286 в 24-луночном планшете при концентрации клеток 1 × 10 клеток/мл, используя в качестве трансфектанта Lipofectamine 2000 Reagent (“Invitrogen”, США. После трансфекции клетки снимали с подложки раствором трипсина, промывали холодным 0,01 М фосфатно-солевым буфером («Биолот», Санкт-Петербург), добавляли буфер, состоящий из 80% 0,01 М фосфатно-солевого буфера и 20% Fetal Bovine Serum и фиксировали клетки 70% этанолом в течение 1 ч при температуре 4 °С. Фиксированные клетки окрашивали пропидия йодидом, далее проводили обработку РНКазой (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit solution, США), после чего инкубировали 3 ч в темноте при температуре 4 °С. Определение фаз клеточного цикла проводили на проточном цитофлюориметре Cytomics FC-500 (“Beckman Coulter”, США) в трех технологических повторах. Для статистической обработки результатов исследований по миграции клеток и клеточному циклу использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Результаты считали значимыми при р < 0,05. Результаты и обсуждение По результатам биоинформационного анализа сигнальных путей, в регуляции которых принимает участие микроРНК-4286, определены 6 значимых путей сигнальной трансдукции (с корректировкой по коэффициенту ложного обнаружения - FDR ≤ 0,05). К числу таких путей относится путь биосинтеза N-гликанов (N-Glycan biosynthesis, hsa00510). Известно, что N-гликаны модулируют функцию многих белков клеточной поверхности, участвующих в миграции и адгезии, в том числе регулирующих миелинизацию [13]. Еще одним путем является сигнальный путь биосинтеза жирных кислот (Fatty acid biosynthesis, hsa00061). Показано, что как нормальные меланоциты, так и клетки меланомы способны синтезировать холестерин. У 60% пациентов с меланомой обнаружено повышение экспрессии генов, отвечающих за синтез холестерина. Повышенный импорт холестерина в клетку за счет активации рецепторов LDL/Apo-B100/LDL приводит к стимуляции пролиферативной активности клеток меланомы [14]. Третий - сигнальный путь метаболизма тирозина (Tyrosine metabolism, hsa00350), аминокислота тирозин принимает участие в синтезе пигмента меланина. L-тирозин играет решающую роль в синтезе меланосом и меланогенезе [15]. Также выявлен сигнальный путь, принимающий участие в развитии глиомы (Glioma, hsa05214). Полный перечень сигнальных путей представлен в таблице. Анализ миграционной активности показал, что статистически значимые различия изменения площади царапины наблюдались через 24 ч после ингибирования микроРНК-4286 (рис. 1). Таким образом, уровень миграционной активности снижается после внедрения в клетки специфического ингибитора микроРНК-4286. Известно, что миграция опухолевых клеток может носить как коллективный, так и индивидуальный характер. При коллективной миграции повышается уровень Е-кадгерина и интегринов [16]. Предполагают, что в коллективной миграции могут принимать участие хемокины, фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста β, трансмембранный гликопротеин подопланин и ряд других белков [16]. Механизмами, лежащими в основе индивидуальной миграции опухолевых клеток, являются эпителиально- мезенхимальный и коллективно-амебоидный переходы. Под эпителиальномезенхимальным переходом подразумевают процесс, в результате которого опухолевая клетка приобретает морфологический фенотип и свойства, присущие мезенхимальной клетке. Для коллективно-амебоидного перехода характерно появление клеток, способных передвигаться за счет «пузыреподобных» выступов клеточной мембраны, появление которых обусловлено быстрыми циклами расширения и сокращения тела клетки. При эпителиально-мезенхимальном переходе активируются транскрипционные факторы TWIST1, Snail, Slug, ZEB1/2, экспрессия протеаз повышается, а Е-кадгерина - снижается. При коллективноамебоидном переходе происходит подавление активности интегринов β1, снижается экспрессия протеаз, изменяется активность белков, относящихся к малым GTPазам: уровень RhoA (Ras Homolog Family Member A, белок семейства ГТФаз) увеличивается, а Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, внутриклеточный белок семейства ГТФаз) - снижается [16]. Гликозилирование, катализаторами которого являются гликозилтрансферазы относится к числу важных посттрансляционных модификаций белков, N-гликозилирование ряда рецепторов мембран клеток, принимающих участие в регуляции клеточной адгезии, миграции, пролиферации играет решающую роль в характере их взаимодействия с лигандами. К числу таких рецепторов относятся рецептор эпителиального фактора роста, интегрины, рецептор трансформирующего фактора роста β [17]. Повышение экспрессии N-ацетилглюкозаминтрансферазы III подавляет фосфорилирование β-катенина, что приводит к стабилизации комплекса β-катенин - Е-кадгерин, предотвращая активацию ряда генов, являющихся триггерами прогрессии опухолевого роста и метастазирования [17]. Следовательно, можно предположить, что блокада микроРНК-4286 изменяет активность гликозилтрансфераз, модулируя N-гликозилирование. Это, в свою очередь, оказывает супрессивное воздействие на миграционный потенциал опухолевых клеток. Анализ клеточного цикла после внедрения в культуру ингибитора микроРНК-4286 показал увеличение процента клеток, находящихся в фазе S-G2 (р < 0,05), свидетельствуя о блокаде митотического деления (фазы М, следующей за G2) (рис. 2). Важную роль в регуляции пролиферации клеток играют интегрины. Получены данные, свидетельствующие о том, что структурные изменения N-гликанов ряда интегринов могут активировать деление клеток. В частности, N-гликозилирование специфического домена интегрина α5 играет важную роль в регуляции клеточного цикла [18]. Возможно, блокада перехода от фазы G2 к митозу в клетках меланомы BRO при ингибировании микроРНК-4286 происходит посредством воздействия на сигнальный путь биосинтеза N-гликанов. Таким образом, микроРНК-4286 играет важную роль в патогенезе меланомы кожи, принимая участие в регуляции процессов миграции, адгезии и пролиферации злокачественных клеток, а использование ингибиторов микроРНК-4286 может стать перспективным направлением терапии данного заболевания.

About the authors

S. V Tsyrenzhapova

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

E. Yu Sergeeva

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

M. B Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

N. V Palkina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

A. V Komina

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

Tatiana G. Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University n.a. V.F. Voyno-Yasenetsky

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD, DSc., assistant professor, head of Pathophysiology Department Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation

References

Supplementary files