Unactivated platelet leukocyte autoplasma in the treatment of non scarring alopecia

Full Text

Таблица 1 Концентрация тромбоцитов (в х 109/л) в периферической крови, неактивированной обогащенной тромбоцитами плазме и неактивированной тромбоцитарно-лейкоцитарной аутоплазме; Me (95% ДИ); р = 0,01 n Периферическая кровь Группа НеОТП НеТЛАП Контрольная 20 207 (149-343) 1000(700-1200) 2300(1500-2500) 15 220 (149-355) 950(730-1100) 2200 (1600-2400) Сегодня каждый человек в своей жизни сталкивается с проблемой повышенного выпадения волос или алопецией. Алопеция - заболевание волосяных фолликулов, приводящее к частичной или полной потере волос, вызванное различными внешними или внутренними факторами. Известно, что рост, цвет, здоровье волос определяют стволовые клетки, которые в изобилии окружают волосяной фолликул. Волосяной сосочек содержит популяцию мезенхимальных стволовых клеток. Эпидермальные стволовые клетки располагаются в особом выпячивании наружного волосяного влагалища (bulge). Периоды регенерации и быстрого роста (анаген) волоса, чередуются с периодами инволюции (катаген) и покоя (телоген) [1]. В течение цикла роста волоса эпителий и мезенхима обмениваются определенным набором молекулярных сигналов, уникальных для каждой стадии. Переход волосяного фолликула из стадии позднего телогена к активному росту в анагене инициируется сигналом от волосяного сосочка, вызывающим вертикальную миграцию стволовых клеток из bulge вниз в область герминативной зоны, где под действием сигналов дермы возникает активная пролиферация и дифференцировка эпидермальных клеток. Это возможно в силу анатомически близкого расположения bulge и волосяного сосочка [1]. Среднее соотношение волос, находящихся в стадии анагена, катагена и тело- гена, составляет, соответственно, 90; 9-10 и менее 1% [1]. При алопеции уменьшается процент волос, находящихся в анагене и катагене, но увеличивается процент телогено- вых волос. Известно, что волосяной фолликул может давать рост новых волос до 30 раз. У пациентов 20-30 лет средняя плотность волос на голове составляет 615 на 1 см2, в возрасте 30-50 лет 485 на 1 см2, в возрасте 80-90 лет показатель снижается до 435 на 1 см2 [2, 3]. н^цовой алошщдай Ежедневная физиологическая потеря волос, равномерная по всей поверхности волосистой части головы, может достигать 100-150 в день. Повышенное выпадение волос приводит к алопеции. В зависимости от патогенеза и клинической картины различают рубцовые и нерубцовые алопеции. К нерубцовым алопециям относят диффузную, очаговую и андрогенетическую алопеции, на долю которых приходится более 80%. Нерубцовые алопеции поражают до 40% людей в возрасте до 50 лет. Доказано положительное влияние на процессы регенерации различных факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF). Тромбоцитарный фактор роста способствует активации пролиферации и миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), фибробластов, гладкомышечных клеток, остеобластов; активации миграции моноцитов, макрофагов, нейтрофилов [4]. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) улучшает микроциркуляцию в коже, участвует в ангиогенезе, индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов, таким образом, поддерживая волосяные фолликулы в состоянии анагена [5]. Эпидермальный фактор роста (EGF) стимулирует миграцию кератиноцитов, способствует пролифера- Таблица 3 Содержание факторов роста в неактивированной обогащенной тромбоцитами плазме и неактивированной тромбоцитарно-лейкоцитарной аутоплазме Исследуемое Факторы роста средство VEGF VEGF-D PDGF-AA PDGF-BB FGF-acidic FGF-basic НеОТП, г/мл 4 6 300 700 0,7 23 НеТЛАП, г/мл 9 10 600 1600 1,7 30 ции эпителиальных, мезенхимальных клеток и фибро- бластов, участвует в ангиогенезе [5]. Инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) играет важную митогенную и морфогенетическую роль в мезенхимально-эпителиальных взаимодействиях между волосяным сосочком и матриксом волоса, обеспечивая клеточную пролиферацию и дифференцировку в зрелом волосяном фолликуле. Локальное введение IGF-1 в кожу овец стимулирует синтез белка и кератина шерсти [6]. У трансгенных мышей с избыточной экспрессией IGF- 1 наблюдается раннее развитие волосяных фолликулов, ускорение цикла роста волос и ускоренная репарация кожи [4]. При подкожном введении мышам фактора роста фибробластов (FGF), волосяные фолликулы которых находятся в стадии телогена, наблюдается их переход в стадию анагена с активацией роста волос [7]. Одним из доступных источников получения факторов роста являются тромбоциты. Репаративные свойства тромбоцитов известны с 1970 г., их используют в различных отраслях медицины, таких как пластическая хирургия, ревматология, стоматология и ортопедия [1]. Стимулирующий эффект обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП, англ.; Platelet Rich Plasma - PRP) проявляется, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1000 x 109/л [8]. Обусловлено это тем, что тромбоциты содержат а-гранулы, которые секретируют цитокины и различные факторы роста [1]. На сегодняшний день основными методами лечения нерубцовых алопеций являются глюкокортикоиды, циклоспорин, миноксидил, контактные ирританты. Однако рост тяжелых торпид- ных форм, низкая эффективность существующих методов лечения, наличие побочных эффектов, сложность соблюдения длительных курсов терапии указывают на необходимость поиска новых методов лечения. Целью нашей работы была разработка метода лечения нерубцовых алопеций неактивированной тромбо- цитарно-лейкоцитарной аутоплазмой (неТЛАП). Материал и методы Под нашим наблюдением в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова Первого МГМУ им. И.М. Сеченова совместно с Центром коллективного пользования «Трансфузионная медицина» (ЦКП) находились 60 больных нерубцовыми алопециями (24 мужчины и 36 женщин) в возрасте от 18 до 72 лет (средний возраст составил 33,3 ± 2,5 года). У 23 (38,4%) больных диагностирована очаговая алопеция, у 22 (36,6%) - андрогенетическая алопеция, и у 15 (25%) - диффузная телогеновая алопеция. Среди сопутствующих заболеваний отмечены аутоиммунный тиреоидит, сахарный диабет 1-го и 2-го типа, гипертоническая болезнь, язвенная болезнь желудка, хронический гастрит, геморрой, бронхиальная астма, хронический синусит, атопический дерматит, роза- цеа, вульгарные угри, истинная экзема, микоз стоп. Перед началом лечения все пациенты проходили обследование, которое включало общий анализ крови (+ тромбоциты), биохимический анализ крови (+ ферритин, гликиро- ванный гемоглобин, С-пептид инсулин), антистрептолизин О (для больных очаговой алопецией), исследование гормонального профиля (тиреотропный гормон - ТТГ), антитела к тиреопероксидазе О, антитела к тиреоглобулину, Т4-свободный, мультистероидный профиль (при андрогенетической алопеции), исследование на антитела к гельминтам (при очаговой алопеции), 25-гидрокси-витамин D3 (при диффузной телогеновой алопеции), рентгенография турецкого седла (по показаниям). Оценку состояния волос и кожи волосистой части головы (фото- Таблица 2 Концентрация лейкоцитов (в х 109/л) в периферической крови и неактивированной тромбоцитарно-лейкоцитарной аутоплазме; Me (95% ДИ); р = 0,01 Группа n Периферическая кровь НеТЛАП Контрольная 20 4,5 (4,1-8,7) 23 (20-27) Больные 15 5,2 (4,5-8,9) 25(21-30) нерубцовой алопецией трихограмма, трихоскопия) проводили с помощью прибора Aramo SG и программы Trichoschience PRO V 1.3. Материалом для определения концентрации тромбоцитов, лейкоцитов, факторов роста в неактивированной обогащенной тромбоцитами плазме (неОТП) и неактивированной тромбоцитарно-лейкоцитарной аутоплазме (неТЛАП) послужила кровь 20 здоровых первичных доноров и 15 больных нерубцовыми алопециями (контрольная группа). Средний возраст составил 33,7 ± 10,1 года. У всех 35 пациентов был проведен забор 2 пробирок крови. Применяли вакуумные пробирки объемом 9 мл с содержанием Na3C6H5O7 3,8%. Для определения исходных показателей клеточного состава крови был проведен клинический анализ крови. Особое внимание уделяли определению концентрации тромбоцитов, с целью исключения тромбоцитозов и тромбоцитопений. Определение концентрации факторов роста (FGF-acidic, FGF-basic, PDGF-AA, PDGF-BB, VeGf, VEGF-D) проводили с помощью технологии xMAP Luminex (“Gen-Probe”) на основе проточной цитометрии (флюориметрии). Исследование проводили с помощью тест-систем Human Angiogenesis Base Kit A (“R&D Systems”), микросфер Luminex Performance assay FGF acidic, FGF basic, PDGF-AA, PDGF-BB, VEGF, VEGF-D (“R&D Systems”) в соответствии с протоколом производителя c учетом его адаптации под использование цитратной плазмы (концентрация фактоpов, в г/мл). Cравнение проводили с помощью теста Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы (95% доверительные интервалы). Для получения неТЛАП необходимое количество крови отбирали из локтевой вены в вакуумные пробирки объемом 9 мл с содержанием Na3C6H5O7 3,8%. Затем подвергали центрифугированию в центрифуге ЕВА 20 при оборотах 500 об/мин в течение 5 мин. В результате 1-го этапа центрифугирования кровь разделяли на три фракции: 1-й слой - эритроциты, 2-й слой - лейкоциты и тромбоциты, 3-й слой - смесь богатой и бедной клетками плазмы. Для получения тромбоцитов в концентрации 1500-2500 x 109/л и лейкоцитов в концентрации 20-30 x 109/л, находящихся в собственной плазме крови, необходимо отобрать слой бедной и богатой клетками плазмы, а также 2-й слой со следовым количеством эритроцитов, и подвергнуть полученную смесь слоев 2-му этапу центрифугирования на оборотах 1200 об/мин в течение 10 мин. Из 9 мл крови получается 1 мл средства, содержащего 15 00-2500 x 109/л тромбоцитов и 20-30 x 109/л лейкоцитов, находящихся в собственной плазме крови. Концентрация клеток в полученном средстве является ключевым аспектом в эффективности предлагаемого метода лечения. Полученную неТЛАП вводили внутрикожно в волосистую часть головы в объеме 0,01 мл на 1 см2 на глубину 2 мм, с интервалом 1 процедура каждые 1-4 недели. Рис. 1. Больной А., а - до лечения; б Фототрихограмма лобной области: До лечения Фототрихограмма: анагеновых всего: 26% (5 на 90,77 мм2) телогеновых всего: 74% (14 на 90,77 мм2) терминальных среди анагеновых: 100% терминальных среди телогеновых: 100% средний диаметр терминальных волос среди анагеновых: 75 мкм. средний диаметр терминальных волос среди телогеновых: 76 мкм. Скорость роста волос: первое значение длины: 264 второе значение длины: 429 период времени между измерениями: 48 ч скорость роста волос: 83 мкм (0,08 мм) за 24 ч 60 лет. Андрогенетическая алопеция. - через 3 мес от начала терапии. в - до лечения; г - через 3 мес от начала терапии. Через 3 мес после начала терапии Фототрихограмма: анагеновых всего: 58% (15 на 171,83 мм2) телогеновых всего: 42% (11 на 171,83 мм2) терминальных среди анагеновых: 100% терминальных среди телогеновых: 82% веллус среди телогеновых: 18% средний диаметр терминальных волос среди анагеновых: 67 мкм. средний диаметр терминальных волос среди телогеновых: 59 мкм. средний диаметр веллуса среди телогеновых: 38 мкм. Скорость роста волос: первое значение длины: 183 второе значение длины: 548 период времени между измерениями: 48 ч скорость роста волос: 183 мкм (0,18 мм) за 24 ч Рис. 2. Больная С., 26 лет. Андрогенетическая алопеция. а - до лечения; в - через 3 мее после начала терапии; Трихоскопия лобной области: б - до лечения; г - через 3 мее от начала терапии. До лечения Плотность/см2: всего: 216 (100%) терминальные: 78 (36%) веллус: 138 (64%) Всего подсчитано/17 мм2 всего: 36 (100%) терминальные: 13 (36%) веллус: 23 (64%) Всего фолликулярных юнитов: 8 фолликулярных юнитов на 1 см2: 48 одиночных фолликулярных юнитов: 100% (8 на 16,67 мм2); Диаметр волос: всего измерено: 30 волос средний диаметр: всех волос 38 ± 4,9 мкм средний диаметр: всех терминальных волос (> 40 мкм) 50 ± 2,2 мкм измерено терминальных волос (> 40 мкм): 43% (13 на 33,33 мм2) измерено веллусных волос (< 40 мкм): 57% (17 на 33,33 мм2) среди терминальных: тонких волос (40-60 мкм): 92% средних волос (60-80 мкм): 8% анизотрихоз: 30 ± 22,2 мкм. Через 3 мес после начала терапии Плотность/см2: всего: 306 (100%) терминальные: 150 (49%) веллус: 156 (51%) Всего подсчитано/17 мм2 всего: 51 (100%) терминальные: 25 (49%) веллус: 26 (51%) Диаметр волос: всего измерено: 47 волос средний диаметр: всех волос 42 ± 3 мкм средний диаметр: всех терминальных волос (> 40 мкм) 53 ± 2 мкм измерено терминальных волос (> 40 мкм): 51% (24 на 33,33 мм2) измерено веллусных волос (< 40 мкм): 49% (23 на 33,33 мм2) среди терминальных: тонких волос (40-60 мкм): 75% средних волос (60-80 мкм): 25% анизотрихоз: 38 ± 19,1 мкм Результаты У больных нерубцовыми алопециями и у добровольцев контрольной группы отмечено значимое увеличение количества тромбоцитов и лейкоцитов при получении неТЛАП (табл. 1, 2). Усовершенствованная и доработанная нами технология отбора клеток позволяет получить тромбоциты в концентрации 1500-2500 x 109/л и лейкоциты в концентрации 20-30 x 109/л, что является ключевым аспектом в эффективности предлагаемого метода лечения. Высокая концентрация факторов роста в неТЛАП определяет целесообразность получения средства, а отсутствие этапа активации позволяет пролонгиро- ванно высвобождать факторы роста из клеток крови в месте введения (табл. 3). В результате проведенного лечения у пациентов, страдающих андрогенетической алопецией, отмечено Рис. 3. Больная М., 63 лет. Очаговая алопеция, субтотальная форма, прогрессирующая стадия. а - до лечения; б - в процессе лечения после 3-х процедур; в - в процессе лечения после 10 процедур; г - через 15 мес от начала терапии. Трихоскопия лобной области: д, е - до лечения; желтые точки - кадаверизированные волосы, в виде черных точек - субтотальная форма; ж - через 6 мес от начала терапии. Плотность/см2: всего: 203 (100%) терминальные: 99 (49%); веллус: 104 (51%) Всего подсчитано/20 мм2 Всего: 41 (100%) терминальные: 20 (49%) веллус: 21 (51%) Диаметр волос: всего измерено: 41 волос средний диаметр: всех волос 44 ± 1,8 мкм средний диаметр: всех терминальных волос (более 40 мкм) 54 ± 1,5 мкм измерено терминальных волос (более 40 мкм): 49% (20 на 20,17 мм2) измерено веллусных волос (менее 40 мкм): 51% (21 на 20,17 мм2) среди терминальных: тонких волос (40-60 мкм): 80% средних волос (60-80 мкм): 20% анизотрихоз: 44 ± 110 мкм. Рис. 4. Б о ль ная О ., 25 лет. Гнездная алопеция, многоочаговая форма, прогрессирующая стадия. Сопутствующие заболевания: бронхиальная астма, атопический дерматит. а - до лечения; в - через 2 года после начала терапии. Трихоскопия затылочной области: б - до лечения; г - через 25 мес от начала терапии. Плотность/см2: всего: 270 (100%) терминальные: 222 (82%); веллус: 48 (18%). Всего подсчитано/17 мм2 всего: 45 (100%) терминальные: 37 (82%) веллус: 8 (18%) Всего фолликулярных юнитов: 16 фолликулярных юнитов на 1 см2: 96 одиночных фолликулярных юнитов: 100% (16 на 16,67 мм2) Диаметр волос: всего измерено: 42 волос средний диаметр: всех волос 58 ± 3,9 мкм средний диаметр: всех терминальных волос (более 40 мкм) 63 ± 3,1 мкм измерено терминальных волос (более 40 мкм): 86% (36 на 33,33 мм2) измерено веллусных волос (менее 40 мкм): 14% (6 на 33,33 мм2) среди терминальных: тонких волос (40-60 мкм): 47% средних волос (60-80 мкм): 44% толстых волос (более 80 мкм): 8% анизотрихоз: 55 ± 24,1 мкм прекращение выпадения волос через 1-2 нед после 1-й процедуры. Через 3 мес после начала лечения увеличивалась плотность волос на 20%. По окончании лечения отмечалось улучшение структуры волос, уменьшение количества седых волос, интенсивный рост стержневых пигментированных волос, значительное повышение скорости роста волос. Отмечена также нормализация работы сальных желез после проведения 1-й процедуры (секрет сальных желез является необходимым условием в процессе миниатюризации волосяного фолликула). По окончании лечения достигнуто клиническое выздоровление у 43%, значительное улучшение у 45%, улучшение у 12% пациентов. Для достижения клинического эффекта потребовалось проведение 8-15 процедур (в среднем 10 процедур) в течение 6-24 мес (в среднем 8 мес) (рис. 1, 2). У больных очаговой алопецией клинический эффект отмечен на 5-7-й день после 1-й процедуры в виде сокращения зоны «расшатанных» волос у 5 больных, что свидетельствовало об остановке прогрессирования заболевания. Интенсивный рост волос наблюдался через 3 нед терапии и к концу курса - восстановление волос в очагах поражения. По окончании лечения было достигнуто клиническое выздоровление у 90%, значительное улучшение у 6%, улучшение у 4% пациентов (рис. 3, 4). Таблица 4 Зависимость эффективности лечения диффузной телогеновой алопеции от кратности введения неактивированной тромбоцитарно-лейкоцитарной аутоплазмы Количество процедур Значительное улучшение Клиническое излечение острая диффузная телогеновая алопеция (П = 8) хроническая диффузная телогеновая алопеция (n = 7) острая диффузная телогеновая алопеция (n = 8) хроническая диффузная телогеновая алопеция (n = 7) 1 5 4 2 - 2 1 3 - - 3 - - 1 4 4 - - - 3 5 Стабильный клинический эффект В группе больных диффузной телогеновой алопецией отмечено прекращение выпадения волос после Рис. 5. Больная Н., 25 лет. Диффузная телогеновая алопеция. а, в - до лечения; б, г - через 3 мес от начала терапии. 1- й процедуры, увеличение плотности волос на 15% через 1 мес от начала лечения. По окончании лечения отмечалось улучшение структуры волос, уменьшение количества седых волос, интенсивный рост стержневых пигментированных волос, значительное повышение скорости роста волос, нормализация работы сальных желез, восстановление роста волос в битемпоральных, височных зонах. Для достижения клинического эффекта необходимо проведение 1-4 процедур (табл. 4). В результате лечения было достигнуто увеличение количества волос, прекращение выпадения волос у всех пациентов, что было отмечено как клиническое выздоровление (рис. 5). После проведенного лечения отмечено нарастание положительной динамики в течение 5-7 мес в виде роста новых стержневых, пигментированных волос. Рекомендуется контроль результатов лечения через 3, 6 мес и после окончания терапии. В ходе нашего исследования, у пациентов, страдающих диффузной телогеновой алопецией отмечался стабильный клинический эффект, в течение 18 мес. Обсуждение Заданная концентрация тромбоцитов и лейкоцитов позволяет получить высокую концентрацию факторов роста в средстве. НеТЛАП позволяет пролонгирован- но высвобождать факторы роста в месте введения средства благодаря сохранению жизнеспособности клеток, что запускает процессы регенерации и роста волос. У всех пациентов были получены убедительные клинические результаты при монотерапии неТЛАП, при этом количество процедур их частота были различны. На длительность курса влияли многие факторы, среди которых первостепенное значение имели стрессогенные ситуации (финансовые трудности, семейные обстоятельства, загруженность на работе). Кроме того, наши наблюдения показали, что у большинства пациентов лабораторные показатели находились в пределах нормы и у 60% больных не было выявлено сопутствующих заболеваний, а у больных андрогенетической алопецией уровень дегидротестостерона не оказывал существенного влияния на течение заболевания. Курс лечения разных форм алопеции составил от 1 до 15 процедур. Пациентам, страдающим диффузной телогеновой алопецией, для достижения терапевтического эффекта достаточно было проведения 1-4 процедур с интервалом 7-10 дней (в среднем 3 процедуры с интервалом 7 дней). Больным очаговой алопецией необходимо было проведение инъекций по всей волосистой части головы до зарастания очагов, 1-й месяц - каждые 7 дней, далее через 3-4 нед (в среднем 7 процедур). У больных андрогенетической алопецией отмечался самый длительный курс лечения: 1-й месяц - каждые 7 дней, 2-й месяц - каждые 2 нед, далее 1 раз в месяц. В среднем длительность терапии составляла 6 мес и зависела от степени миниатюризации волосяных фолликулов (в среднем 10 процедур). Таким образом, внутрикожное введение неТЛАП в качестве монотерапии является высокоэффективным методом лечения нерубцовых алопеций. На основании выполненных исследований был получен патент РФ №2583552 от 30.03.15.

About the authors

G. A Ragimov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Dermatology and Venereology, Department of Clinical Transfusion Moscow, 119991, Russian Federation

O. Yu Olisova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Department of Dermatology and Venereology Moscow, 119991, Russian Federation

Kseniya G. Egorova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: drksenia87@gmail.com
junior researcher of Research Center, Postgraduate student of Department of Dermatology and Venereology of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University Moscow, 119991, Russian Federation

References

Supplementary files