Expression of heat shock proteins HSP90 on neutrophils peripheral blood in patients with atopic dermatitis

Full Text

Атопический дерматит (АД) - полиэтиологическое заболевание с наследственной предрасположенностью, причем наследование носит полигенный характер. Среди экзогенных факторов, оказывающих провоцирующее влияние на возникновение и развитие АД, наибольшее значение имеют пищевые продукты, ингаляционные аллергены, раздражители физического. животного и растительного происхождения, метеовоздействие, стрессовые факторы. Поскольку АД является стресс-зависимым заболеванием, а белки теплового шока (Heat Shock Proteins - HSP) обусловливают молекулярные события при стрессе, есть основания полагать, что они принимают участие в развитии АД. Однако значение HSP90 в молекулярных механизмах АД не изучено. Регуляторная сеть, включающая HSP, их факторы транскрипции, ДНК-связующие элементы и другие сигнальные молекулы, определяют устойчивость клеток и всего организма к стрессу. Суперсемейство HSP подразделяют на семейства в зависимости от молекулярной массы: 90 кД (HSP90). 70 кД (HSPA), 40 кД (DNAJ, HSP40), а также малые белки (HSPB) и шаперонины. Семейство HSP90 человека включает 5 белков- шаперонов (HSP90AA1, HSP90AA3P, HSP90AB1, HSP90B1, TRAP1), принимающих участие в фолдинге (процесс правильного сворачивания полипептидной цепи в определенную пространственную структуру) белков и защищающих другие белки от деградации при стрессе (http://genenames. org/genefamilies/HSP#HSP90). В нормальной клетке в физиологическом состоянии HSP90 составляют 1-2% всего пула внутриклеточных белков; при стрессе - 4-6% [1]. Белки теплового шока HSP90 локализуются не только во внутриклеточных структурах, но и на поверхности клетки [2]. Они входят в состав многомерного рецепторного комплекса на плазматической мембране нейтрофилов, включающего рецепторы хемокинов, интегринов, а также TLR, CD 11b и CD16-рецепторы. Одна из функций HSP90 - перемещение и экстернализация рецептора CD16 [3]. HSP90 ассоциирован с вольтажзависимыми хлорными каналами мембраны клеток, регулирующими гомеостаз при повышении температуры тела, ишемии, окислительном стрессе [4]. HSP90 сопряжен с белками сигнальных путей STAT3 и STAT1 в кавеолин-1- содержащих липидных рафтах плазматической мембраны и в цитозоле, что позволяет HSP90 регулировать сигналы от IL-6/STAГ3/МАРК-киназ. Установлено повышение экспрессии белков теплового шока в кератиноцитах и фибробластах больных АД [5] и повышение экспрессии белка HSP90 при проведении кожных тестов на аллергены [6]. Ряд авторов [7-9] выявил участие HSP90 в дифференцировке и функциональной активности Т-лимфоцитов, играющих определяющую роль в развитии патологических изменений в коже при АД. Есть также данные, косвенно указывающие на участие HSP90 в развитии АД у людей [10]. Цель данного исследования - изучение экспрессии HSP90 на плазматической мембране нейтрофилов больных АД. Для корреспонденции: Морозов Сергей Георгиевич, доктор мед. наук, профессор, член- корреспондент РАН, заместитель директора по научной работе и заведующий лабораторией «Общей и перинатальной нейроиммунопатологии» ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», 125315, г. Москва, Россия. E-mail: biopharm@list.ru. For correspondence: Morozov Sergey G., Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of Russian Academy of Sciences, deputy director for scientific work of Federal State Budgetary Scientific Institution of Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, 125315, Russian Federation. E-mail: biopharm@list.ru. Information about authors: Elistratova I.V., http://orcid.org/0000-0002-0393-4947; Morozov S.G., http://orcid.org/0000-0001-5822-5729; Zakharova I.A., http://orcid.org/0000-0002-5648-4214. Материал и методы Обследованы 216 больных АД мужчин в возрасте от 18 до 38 лет, поступивших на стационарное лечение в отделение дерматовенерологии ФКУ «Главного военного клинического госпиталя внутренних войск МВД России». Все пациенты подписывали форму информированного согласия. Критериями исключения пациентов из исследования являлись наличие острых вирусных или бактериальных инфекций, онкологических и соматических, системных аллергических или воспалительных заболеваний, психомоторных расстройств. При оценке тяжести течения АД использовали индекс SCORAD. В исследовании приняли участие 64 пациента с легкой формой АД (менее 20 баллов), 119 пациента со средней тяжестью заболевания (20-40 баллов) и 33 - с тяжелой формой АД (40-60 баллов). Для оценки роли аллергенов окружающей среды использовали тест «кожного пятна» (patch test) [11]. Всем пациентам проводили лабораторные исследования, включающие общий анализ крови и мочи, иммунного статуса с определением концентрации общего и специфического @Е. Группу контроля составили 62 здоровых донора (мужчины в возрасте от 19 до 34 лет), в анамнезе которых отсутствовали хронические воспалительные, аллергические и диагностированные онкологические заболевания. В течение 30 дней до обследования доноры не должны были принимать лекарственные препараты, а также не должны были употреблять алкоголь в течение 2 суток до обследования. При осмотре кожные покровы доноров были свободны от высыпаний. Доноров, участвовавших в данном эксперименте, обследовали на бактериальное инфицирование кожных покровов для исключения ложноположительных результатов. Все доноры подписывали информированное согласие, идентичное информированному согласию пациентов. Кровь брали натощак из локтевой вены в вакутейнер с ЭДТА. Число популяций клеток в 1 мл периферической крови определяли на гематологическом анализаторе LH700 (“Beckman Coulter”, США). Для получения лейкоцитарной взвеси кровь переносили в центрифужные пробирки и добавляли по 15 мл лизирующей жидкости (коммерческий препарат фирмы “Becton Dickinson” для удаления эритроцитов). Инкубировали 5 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 200g. Супернатант удаляли, осадок встряхивали, добавляли «среду 199» и отмывали суспензию клеток центрифугированием. К клеткам крови в концентрации 0,5 х 106 клеток в 50 мкл PBS добавляли 2 мкл мышиных моноклональных антител H90- 10 (ab58950, “Abcam”) к белкам HSP90 человека и инкубировали в течение 50 мин при температуре 4оС, затем отмывали центрифугированием при 400g, добавляли 50 мкл холодного 3% BSA на PBS и 10 мкл изотипспецифических Fab-фрагментов Ig, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) (“Abcam”). Клетки инкубировали 40 мин в темноте при температуре 4оС, затем отмывали центрифугированием при 400g, осадок встряхивали и фиксировали 2% параформальдегидом на PBS с 1% азидом натрия (http://abcam.com/protocols). В зависимости от размеров клетки, формы, величины ядра, гомогенности цитоплазмы и других параметров, определяемых при прямом и боковом просвечивании лазером, клетки распределялись в системе координат на каналах FSC-А/SSC-А (Forward Scate Cells & Side Scate Cells). Клетки одной популяции имеют сходные физические характеристики и располагаются компактно в зоне, которая в данном методе исследования называется гейтом. Прибор нумерует гейты и определяет в них число и процент клеток. В каждом образце анализировали 10 000 событий на гейт. Для определения процента клеток, окрашенных mAb, на проточном цитометре определяли флюоресценцию FITC на канале FL1 при длине волны 530 ± 5 нм. В качестве негативного контроля измеряли флюоресценцию F(ab’)2 фрагментов иммуноглобулинов, меченных FITC. Анализировали гистограмму, соответствующую флюоресценции FITC в гейте, по которой определяли процентное содержание клеток, экспрессирующих исследуемый антиген, и интенсивность флюоресценции для каждого образца, отражающую относительную плотность антигена на поверхности клетки. Все эксперименты проводили в повторах, полученные данные представлены как М ± m. Данные анализировали по программе ANOVA. Сравнение между двумя группами проводили по г-критерию Стьюдента, статистический анализ нескольких групп проводили с помощью непараметрического анализа методом мно- Т аблица 1 Экспрессия белков теплового шока 90 на поверхности нейтрофилов периферической крови у больных атопическим дерматитом различной степени тяжести Классификация по индексу SCORAD Показатель Доноры (n = 62) легкое течение, менее 20 (n = 64) средней тяжести, 20-40 (n = 119) тяжелое течение, 40-60 (n = 24) тяжелое течение, выше 60 (n = 9) ШР90+-клетки, % 15 ± 4 36 ± 8 44 ± 7 65 ± 9 71 ± 5 Интенсивность флюоресценции HSP90, усл.ед. 21 ± 3 39 ± 7 64 ± 6 85 ± 5 89 ± 5 жественного сравнения по критерию Ньюмена-Кейлса; p < 0,05 расценивали как статистически значимое различие между группами. Исследование крови больных проводили только до начала лечения. Экспрессию HSP90 определяли на поверхности непер- меабилизованных клеток крови, которые окрашивали антителами сразу после их выделения, что исключало различия, связанные с гибелью нейтрофилов. Результаты Установлена экспрессия HSP90 на клетках крови больных АД. Максимальный уровень экспрессии обнаружен на моноцитах, менее выраженный - на нейтрофилах и лимфоцитах. У доноров экспрессия HSP90 на нейтрофилах достаточно выражена. Выявлены, как минимум, два пула нейтрофилов, различно экспрессирующих HSP90. По сравнению с донорами у больных АД повышен процент нейтрофилов, несущих на мембране белки теплового шока HSP90 (р < 0,05). Выявлена положительная зависимость экспрессии белков HSP90 на плазматической мембране нейтрофилов от степени тяжести заболевания. Статистически значимые различия (р < 0,05) установлены для процента Н8Р90-положительных нейтрофилов при легком и тяжелом течении АД. Также статистически значимые различия относительной плотности белков HSP90 на поверхности клеток выявлены между легкой и среднетяжелой формами течения АД (р < 0,05), а также между легким и тяжелым течением заболевания (р < 0,001) (табл. 1). Выявлена также положительная динамика роста числа клеток, несущих HSP90 на мембране в зависимости от площади поражения (табл. 2). Статистически значимые различия (р < 0,05) установлены для числа ЖР90-положительных нейтрофилов между локализованным и диффузным типами поражения АД. По интенсивности флюоресценции (относительной плотности белков HSP90) на поверхности клеток статистически значимые различия (р < 0,05) выявлены также между локализованным и диффузным типами АД (р < 0,05). Анализ результатов в зависимости от фазы течения (острая, подострая, хроническая) на момент забора крови показал значительный разброс данных. Однако при хроническом течении заболевания среднее значение числа ней- трофилов, экспрессирующих HSP90 на поверхности клеток, снижено по сравнению с острой фазой заболевания: 46 ± 13% против 64 ± 14%. Наиболее значимое повышение числа нейтрофилов с HSP90 на поверхности клеток зарегистрировано в период между 2-й и 3-й неделями обострения заболевания. Имелась тенденция к снижению числа HSP90- положительных нейтрофилов на 3-й неделе обострения АД (табл. 3). При сравнении группы больных АД, имевших высокие значения сывороточного иммуноглобулина IgE (n = 184), и группы с нормальными значениями IgE (n = 32) не установлено различий в экспрессии белка теплового шока HSP90 на мембране нейтрофилов в зависимости от концентрации IgE в сыворотке крови. Таблица 2 Экспрессия белков теплового шока HSP90 на поверхности нейтрофилов периферической крови больных атопическим дерматитом в зависимости от площади поражения Классификация типов распространенности процесса (по согласительному протоколу 2002 г.) Показатель ограниченно локализованный (n = 63) распространенный (n = 119) диффузный (n = 34) ШР90+-клетки, % 45 ± 7 54 ± 8 65 ± 11 Интенсивность флюоресценции HSP90, усл.ед. 46 ± 8 63 ± 7 75 ± 9 Обсуждение Наше исследование показало, что нейтрофилы периферической крови больных АД экспрессируют высокий уровень белка теплового шока HSP90 на своей плазматической мембране. Выявлена положительная корреляция экспрессии данного белка от степени тяжести заболевания. Показано, что существует два пула клеток, различно экспрессирующих HSP90, однако эти исследования требуют уточнения, поэтому скорее можно говорить о гетерогенности состава клеток, экспрессирующих HSP90 на плазматической мембране. У больных АД повышена интенсивность флюоресценции нейтрофилов, несущих на мембране определяемые данными антителами белки теплового шока HSP90. Однако следует отметить, что для такого рода исследований моноклональные антитела имеют определенный недостаток по сравнению с поликлональными, так как их получают к определенным эпитопам, которые могут быть конформационно изменены при различных патологических условиях в организме человека. Выявлена четкая тенденция к снижению уровня экспрессии HSP90 на мембране нейтрофилов на сроке более 21 дня с начала периода обострения АД. С точки зрения участия нейтрофилов в развитии и поддержании воспалительного процесса в коже, экспрессия HSP90 на плазматической мембране клеток представляется более значимой по сравнению с изменением содержания HSP90 внутри клетки, так как на плазматической мембране клеток белок HSP90 входит в рецепторные комплексы в рафтах или в кавеолах, в частности, на плазматической мембране нейтрофилов HSP90 регулирует экспрессию рецепторов CD16 [3]. Кроме того, HSP90 выполняет транспортную функцию, перемещая определенные рецепторы на плазматическую мембрану. Так как данные литературы по HSP90 при АД отсутствуют, можно предполагать, что HSP90 выполняет те же функции, что и при других воспалительных заболеваниях. Например, при связывании бактериями рецептора TLR4 на поверхности моноцитов формируется комплекс, состоящий из HSP90, HSP70, TLR4, который передает стимулирующий сигнал для активации иммунного ответа [2]. Транслокация HSP90 на поверхность клетки из цитозоля наблюдается в клетках кожи под действием ультрафиолета, при этом мембранносвязан- Таблица 3 Экспрессия HSP90 на поверхности нейтрофилов периферической крови у больных атопическим дерматитом в зависимости от длительности данного периода обострения Длительность периода обострения Показатель не более 7 дней (n = 30) 8-20 дней (n = 64) более 21 дня (n = 43) ШР90+-клетки, % 53 ± 9% 68 ± 8% 59 ± 8% Интенсивность флюоресценции HSP90, усл.ед. 70 ± 4 87 ± 5 78 ± 5 ные HSP способствуют высвобождению интерлейкинов IL-6, IL-1P во внеклеточное пространство [13]. Одновременно повышается экспрессия рецепторов CD80 и CD86 на дендритных клетках кожи, что приводит к изменениям их функциональной активности. Появление белков HSP90 на поверхности плазматической мембраны клеток может распознаваться макрофагами как сигнал к фагоцитозу клеток, подвергающихся апоптозу. Этим частично можно объяснить повышенную гибель клеток в пораженных участках кожи при АД. Известно, что при сходе с поверхности клеток белок HSP90 имеет укороченную форму и подвергается посттран- сляционной модификации (shedding-процесс). Циркулирующие белки HSP90 регулируют ангиогенез, межклеточные взаимодействия, активируют Т-лимфоциты, регулируют экспрессию протеазо-активированных рецепторов и т.д. Экстра- клеточные HSP90 взаимодействуют с рецепторами TLR4 и связывают бактериальные липополисахариды. За счет взаи- модейтвия с рецепторами TLR4 белки HSP90 трансактивиру- ют сигнальные пути от рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR/ErbB1), а также сигнальные пути протеин- киназы С-дельта (PKC5/c-Src) [14]. Какую именно функцию выполняют белки HSP90 на поверхности нейтрофилов при АД еще предстоит выяснить. Выводы • нейтрофилы больных АД экспрессируют белки теплового шока HSP90 на плазматической мембране; • уровень экспрессии HSP90 коррелирует с тяжестью течения АД. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

I. V Elistratova

Main Military Clinical Hospital of Internal Troops of the Ministry of Internal Affairs of Russia

Balashiha, 143915, Russian Federation

Sergey G. Morozov

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: biopharm@list.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of Russian Academy of Sciences, deputy director for scientific work of Federal State Budgetary Scientific Institution of Institute of General Pathology and Pathophysiology Moscow, 125315, Russian Federation

I. A Zakharova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Moscow, 125315, Russian Federation

References

Supplementary files