Tumor stem cells: Melanoma

Full Text

Стволовые клетки характеризуются способностью к дифференцировке в различные виды клеток и в то же время могут длительно существовать и самообновляться, оставаясь в недифференцированном состоянии. Стволовые клетки можно разделить на несколько видов. Тотипотентные, которые могут дифференцироваться в клетки эмбриональных и экстраэмбриональных тканей, плюрипотентные - формировать только эмбриональные ткани (экто-, мезо- и эндодерму), мультипотентные - дифференцироваться в ограниченное число различных типов клеток, что зависит от уровня предшествующей диф- ференцировки [1]. Важно отметить, что стволовые клетки могут быть получены из других типов дифференцированных клеток посредством перепрограммирования. Замечательным в этом плане является эксперимент K. Takahashi и S. Yamanaka [2], показавший способность перепрограммирования зрелых мышиных фибробластов в так называемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки благодаря изменению экспрессии четырех генов - Oct-3/4, Sox2, c-Myc, KLF4. Опухолевые стволовые клетки Подобно нормальным тканям, обладающим способностью к регенерации опухоли имеют иерархическую структуру организации и опухолевые стволовые клетки (ОСК) как и нормальные стволовые клетки, имеют свои структурные и функциональные особенности. В первую очередь ОСК могут являться родоначальниками опухолевых клеток любого типа, присутствующих в данной опухоли, они обладают способностью к самообновлению, а также генерации нестволовых опухолевых клеток, которые составляют основу опухолевого очага [3]. ОСК представляют не только фундаментальный, но и клинический интерес в связи с тем, что с их функционированием связывают высокую летальность пациентов от злокачественных новообразований, развитие рецидивов опухоли, а также ее резистентность к лучевой и химиотерапии. Р. Вирхов еще в середине XIX века писал, что некоторые виды опухолей могут происходить из эмбриональных клеток. Идентификация и функционирование ОСК впервые были рассмотрены в работах G. Pierce и S. Speers [4] и в дальнейшем подтверждены D. Bonnet и J. Dick [5], показавших, что единичная клетка острого миелолейкоза, экспрессирующая маркеры стволовых клеток, может дать начало развитию генерализованной опухоли при трансплантации in vivo. Таким образом, ОСК подобны нормальной стволовой клетке существуют в «спящем» состоянии большую часть времени и только иногда входят в клеточный цикл для самообновления и дифференци- ровки с целью дальнейшего увеличения опухолевой массы [6]. Известно, что ткань опухоли гетерогенна и включает клетки, которые могут характеризоваться генетическими и эпигенетическими различиями в пределах одной опухоли, в том числе на разных этапах ее развития [7]. Возможно, что ОСК происходят из нормальных стволовых клеток, подвергшихся трансформации генома и/или эпигенетической модификации в результате мутаций или воздействия неблагоприятных факторов внешней среды. С другой стороны, существуют предположения о пластичности опухолевых клеток, благодаря которой может происходить их дедифференцировка в ОСК [8]. Согласно стохастической модели опухоли, все опухолевые клетки эквивалентны друг другу, но их дальнейшая судьба регулируется внутренними сигналами, а также воздействием факторов внешней среды. Дочерние клетки обладают свойством стволовых клеток. В иерархической модели ОСК биологически различны, могут воспроизводить дочерние клетки, которые не имеют способности к самообновлению [9]. Сомнения в иерархической структуре организации опухоли возникли при исследовании стволовых клеток меланомы, когда было показано, что состояние опухолевого очага не статично: по крайней мере некоторые опухолевые клетки могут приобретать черты стволовых клеток под воздействием микроокружения, физических и химических факторов. В этой связи эпителиально-мезенхимальный переход, являющийся важным этапом при развитии инвазивных качеств опухолевых клеток, их подвижности, что составляет основу формирования метастазиро- вания, также может рассматриваться как процесс изменения статуса опухолевых клеток, изменения экспрессии на их поверхности маркеров ОСК, приобретения черт, свойственных последним [10]. Маркеры стволовых клеток Вопрос о маркерах стволовых клеток не является однозначным на сегодняшний день. Вместе с тем идентификация ОСК важна не только для экспериментальной онкологии, но и для целевого терапевтического воздействия на опухолевую популяцию стволовых клеток. Многие маркеры ОСК являются белками, расположенными на поверхности клетки, которые позволяют выделять популяцию ОСК при помощи флуоресцентной микроскопии, иммуно- гистохимических методов. При этом данные белки зачастую не имеют никакого отношения к биологии стволовой клетки. Дополнительные трудности заключаются в том, что экспрессия данных маркеров не является стабильной и клетки, положительные или отрицательные по отношению к определенному маркеру, могут в дальнейшем быть предшественниками как положительных, так и отрицательных дочерних клеток [11]. Кроме того, маркеры могут не быть уникальными для какого-то одного типа, а выявляться и в других типах клеток. Примерами таких молекул могут являться такие белки, как СD44, CD24, CD20, которые были идентифицированы в различных типах опухолевых клеточных линий и биоптатах пациентов наблюдали ко-экспрессию ОСК и «стандартных» маркеров той или иной опухоли. Первыми были охарактеризованы ОСК в солидной опухоли рака молочной железы. Эти клетки экспрессировали CD44, но были отрицательны для CD24 [12]. Аналогичные данные были получены при других солидных опухолях, таких как рак головного мозга или кишечника [13]. CD20-положительные клетки обнаружены и на B-лимфоцитах здоровых людей, и в стволовых клетках меланомы, что требует их дальнейшего изучения как предполагаемого маркера стволовых клеток меланомы и возможная терапевтическая мишень [14]. В эксперименте установлено, что при введении мышам с меланомой кожи CD20 экспрессирующих стволовых клеток меланомы кожи, полученных от больных меланомой кожи, у животных наблюдался цитотоксический эффект и снижение количества рецидивов на экспериментальной модели меланомы кожи [15]. Можно выделить несколько групп маркеров ОСК [16]: • белки, расположенные на поверхности клетки (CD133, IL-3r, CD184, EpCAM); • компоненты сигнальных путей, связанных со способностью клетки к самообновлению (Hedgehog, Notch, Wnt/p-катенин, BMI, BM1, PTEN); • структурные/функциональные компоненты ниш стволовых клеток; • белки, участвующие в системах детоксикации (ABC-транспортеры, альдегиддегидрогеназа); • теломераза, а также факторы, связанные со старением клетки; • онкогены и онкосупрессоры; • отдельные виды микроРНК. CD 133, известный также как проминин-1, является мембранным белком. В норме он выявлен на поверхности незрелых кроветворных и стволовых клеток нервной ткани [17], а также в различных типах опухолей, включая меланому [18]. Выявлено, что CD133 экспрессирующие клетки обладают мульти- потентностью и способностью к самообновлению, а также могут инициировать опухолевый рост [19]. Ингибирование экспрессии CD133 в меланоме приводит к снижению роста опухолевых клеток и склонности к метастазированию новообразования [20]. Представители семейства транспортных белков аденозинтрифосфата ^ХФ) также были выявлены в стволовых клетках меланомы. Данная группа белков гидролизирует АТФ для транспортировки некоторых субстратов [21]. Высокая экспрессия данных молекул при различных видах опухолей и, в частности, при меланоме кожи может способствовать формированию у данной группы пациентов множественной лекарственной устойчивости в связи с возможной модуляцией процесса захвата клетками противоопухолевых препаратов. В частности, эти белки могут ограничивать всасывание, распределение и проникновение вемурафениба, препарата для лечения меланомы кожи, ассоциированной с мутацией онкогена BRAF [22]. В стволовых клетках меланомы была описана экспрессия CD271, характеризующаяся низкой аффинностью к рецепторам фактора роста нервов (NGFR). Повышенные уровни CD271 ассоциированы с периневральной инвазией и миграцией клеток меланомы. Доказано, что поведение СD271- положительных клеток аналогично опухолевым стволовым клеткам [23]. Методы анализа функционирования опухолевых стволовых клеток Использование ксенотрансплантации, т.е. трансплантации отдельных ОСК модельному животному, является «золотым» стандартом для исследования ОСК, но при использовании данной модели не поддерживается естественная среда для ОСК. Стволовые клетки в таком случае в той или иной степени попадают под влияние клеток иммунной системы животного. Многие из этих исследований используют мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом - SCID или NOD со спонтанно развивающимся сахарным диабетом, но без ожирения (модель, напоминающая сахарный диабет 1-го типа у людей) [24, 25]. Некоторые из исследований используют матри- гель для трансплантации опухолей, представляющий собой вещество, которое может способствовать образованию и развитию опухолей [26]. В этой модели влияние на биологическое поведение ОСК могут оказывать различия в методах очистки клеток, например тип фермента (трипсин или коллагеназа), концентрация данных ферментов и продолжительность воздействия им. Имеются ряд ограничений для применения моделей для изучения стволовых клеток меланомы. Одной из главных проблем является наличие иммунологического барьера для трансплантации ОСК лабораторным животным. Одним из способов преодоления данной проблемы является использование иммунодефицитных животных, применение аутологичных стволовых клеток, а также десенсибилизация организма реципиента стволовыми ксеноклетками [27]. Таким образом, ныне существующие системы для ксенотрансплантации обладают рядом недостатков. Вместе с тем в настоящее время существуют несколько трансгенных моделей меланомы, которые напоминают по характеру течения, прогрессии и ме- тастазирования модель меланомы человека [28, 29]. Стволовые клетки меланоцитов Меланоциты происходят из плюрипотентных клеток нервного гребня как непигментированные мела- нобласты [30, 31]. Далее происходит их миграция в дорсолатеральном направлении с последующим распределением меланобластов в базальном слое эпидермиса и волосяных фолликулах [32]. Меланобла- сты, достигающие эпидермиса, дифференцируются в пигментобразующие меланоциты, после чего происходит дифференцировка на MITF-положительные и MITF-отрицательные типы. Стволовые клетки меланоцитов способны супрессировать Wnt-сигнальный каскад и увеличивать экспрессию генов TGF-ft сигнального пути [33]. В отличие от стволовых клеток меланоцитов, дифференцированные меланоциты производят меланин в специальных органоидах-ме- ланосомах, которые передаются через дендритные отростки этих клеток до соседних кератиноцитов, где они защищают ядра клеток от мутационного действия ультрафиолетового излучения. Для каждого цикла роста волос и развития новых волосяных фолликулов необходима активация стволовых клеток меланоцитов и дальнейшая диффе- ренцировка меланоцитов в луковице волоса. Потеря стволовых клеток меланоцитов или отсутствие их активации может приводить к поседению и выпадению волос [34]. Wnt/P-катенин сигнальный механизм является не только одним из ключевых факторов в развитии новых волосяных фолликулов, но и включен в процесс активации стволовых клеток мелано- цитов. Кроме того, Wnt/P-катенин - сигнальный путь регулирует экспрессию MITF [35]. В свою очередь Р-катенин взаимодействует непосредственно с MITF, модулируя тем самым регуляцию его транскрипции [30]. К другим регуляторам стволовых клеток меланоцитов относится трансформирующий фактор-Р (TGF-P) - сигнальная молекула с широким спектром мишеней, включающих MITF, PAX3, тирозиназу [36]. У стволовых клеток меланоцитов имеются определенные качества, которые делают их очень привлекательной моделью для изучения стволовых клеток. Во-первых, они могут быть получены из кожи относительно безинвазивным способом. В коже стволовые клетки расположены в пределах определенной анатомической ниши, тем самым облегчая их поиск и выделение. Во-вторых, экспансия и дифференци- ровка дочерних клеток тесно связаны с жизненным циклом роста волос. Стволовые клетки меланоцитов проникают в волосяной фолликул и играют важную роль в циклических изменениях в волосяных фолликулах. Таким образом, при ингибировании стволовых клеток может уменьшаться пролиферативная активность меланоцитов [37]. Помимо этого, дисфункция данной группы клеток легко идентифицируется через дефекты в пигментации. Например, Bcl-дефицитные состояния, приводящие к активации апоптоза в стволовых клетках меланоцитов, проявляются поседением и выпадением волос [38]. Кроме того, меланоциты обладают некоторыми преимуществами, важными для многих экспериментальных исследований, в частности это относительно длинный жизненный цикл стволовой клетки меланоцита по сравнению с другими клетками кожи, например с кератиноцитами. Опухолевые клетки меланомы Хорошо известная высокая гетерогенность опухолевых клеток меланомы явилась одной из предпосылок к изучению наличия/функционирования ОСК в этой опухоли. Выявлено, что клетки меланомы, экспрессирующие маркер стволовых клеток ABCB5, белок семейства ABC-транспортеров, резистентны к противоопухолевому препарату доксорубицину [39]. In vivo клетки меланомы, экспрессирующие другой маркер опухолевых стволовых клеток - CD271, вызывали формирование опухолевого очага в 72% случаев, тогда как CD271-отрицательные клетки только в 7% [40]. Меланомы с высоким уровнем экспрессии маркера стволовых клеток альдегиддегидрогеназы характеризовались худшим клиническим исходом [41]. Таким образом, гетерогенность меланомы подтверждается наличием в пуле опухолевых клеток ОСК. Ключевым событием в развитии меланомы является переход из радиальной фазы роста в вертикальную и соответственный рост потенциала к ме- тастазированию опухоли. Молекулярные механизмы могут быть представлены двумя путями, каждый из которых имеет существенные различия. В так называемой генетической модели приобретение генетической мутации в прометастазах представляет собой необратимое событие, при котором метастазы будут генетически отличны от клеток первичной опухоли. В альтернативной модели стволовые клетки меланомы рассматриваются в качестве предикторов метастазов: фенотипическая гетерогенность обусловлена специфической программой экспрессии гена, обеспечиваемой клеточным микроокружением [42]. С другой стороны, скорость перехода от инвазивного фенотипа к пролиферативному очень низкая, состояние покоя в клетке может быть длительным. Если опухолевые клетки с высоким инвазивным потенциалом столкнутся с особыми клеточными «нишами», где будут отсутствовать промиграционные и пролиферативные сигналы, они могут остаться в состоянии покоя на долгие годы, представляя собой так называемые спящие клетки. Но все это время они будут сохранять свой потенциал возвращения в пролиферативное состояние. Существуют предположения, что даже если все клетки меланомы будут обладать активирующими мутациями в генах BRAF и NRAS, опухоль должна получать про-пролиферативные сигналы и наличие данных сигналов выводит клетку из состояния покоя, стимулируя интенсивную пролиферацию в клетке [43, 44]. В поддержку данной теории есть многочисленные свидетельства. Так, в развитии меланобластов проявляется внутренняя миграционная способность, которая включается и выключается от внеклеточных сигналов, что приводит к реализации точной и скоординированной программы пролиферации и миграции клеток от нервного гребня по специфичным путям в эмбриогенез [45]. Кроме того, при меланоме часто клетки теряют способность к экспрессии E-кадгерина, одновременно с приобретением инвазивных свойств опухоли, а затем вновь приобретают это свойство с появлением метастазов опухоли [46]. Клетки микроокружения опухоли, секретирующие компоненты внеклеточного матрикса, могут модифицировать и перепрограммировать нормальные меланоциты в сторону инвазивного фенотипа [47], что играет существенную роль в прогрессии меланомы. Фактор роста стволовых клеток и c-KIT Фактор роста стволовых клеток (stem cell factor, SCF) продуцируется фибробластами и эндотелиоци- тами и является важным цитокином, регулирующим гемопоэз, сперматогенез и продукцию меланина. Он обладает регуляторным действием на мелано- циты посредством паракринных стимулов, отвечает за адекватную финальную миграцию меланоцитов в эпидермис [48]. Рецептором SCF является c-KIT. Связывание последнего с SCF вызывает гомодиме- ризацию c-KIT, последующую активацию внутриклеточных киназ и аутофосфорилирование остатков тирозина. с-KIT имеет несколько потенциальных участков для фосфорилирования, которые взаимодействуют с расположенными в клетке сигнальными каскадами, включающими фосфатидилинозитол-3- киназный путь, каскад митогенактивируемых про- теинканаз, киназный путь Src [49]. Роль мутаций гена c-KIT в патогенезе отдельных разновидностей меланомы считается общепризнанной [50]. Недавние полногеномные исследования выявили, что наличие мутаций в гене c-KIT характерно для акраль- но-лентигинозной меланомы, меланомы слизистых оболочек, а также меланомы кожи, локализованной на участках тела, подверженных хроническому воздействию ультрафиолетового облучения [51]. Большинство мутаций в гене c-KIT обнаруживают в юк- стамембранном домене рецептора [52]. Мутации приводят к активации как c-KIT, так и внутриклеточных механизмов передачи сигнала. Терапия c-KIT- позитивных опухолей с применением ингибитора тирозинкиназ иматиниба рассматривается как один из персонализированных подходов в онкологии [53]. Недавние исследования выявили, что, помимо генетических аберраций, ген c-KIT, в частности его про- моторная область, являются часто подверженными эпигенетическим изменениям - гиперметилированию [54]. Таким образом, ОСК не только влияют на гетерогенность и пластичность меланомы, но и могут быть связаны с нарушением функционирования компонентов клетки, что является важным в развитии и прогрессии меланомы. Стволовые клетки открывают возможности для научных достижений, которые далеко выходят за рамки регенерационной медицины. Исследования функциональных аспектов стволовых клеток способствуют пониманию ряда вопросов при изучении механизмов старения и канцерогенеза. Кроме того, ОСК должны являться одним из компонентов изучения противоопухолевой эффективности лекарственных препаратов.

About the authors

Tatiana G. Ruksha

V.F. Voido-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD, DSc 660022, Krasnoyarsk, Russia

M. B Aksenenko

V.F. Voido-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

Yu. A Fefelova

V.F. Voido-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: fefelovaja@mail.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files