SUPPRESSIVE EFFECTS OF PSORALENE PHOTO-OXIDATION PRODUCTS ON CONTACT SENSITIVITY REACTION IN MICE: LYMPHOCYTE PROLIFERATION INHIBITION AND APOPTOSIS INDUCTION

Full Text

Одним из эффективных методов лечения иммунопатологий, опосредованных Т-лимфоцитами, например аллергического контактного дерматита, является ПУВА-терапия. Она заключается в воздействии УФ диапазона А (УФА) на кожу пациента, предварительно получившего перорально или внутривенно препарат псоралена [1]. Однако ПУВА-терапия может сопровождаться некоторыми побочными эффектами, например эритемой, отеком, гиперпигментацией, а иногда раком кожи [2]. При проведении ПУВА-терапии в коже пациента происходит фотолиз псоралена с образованием продуктов его фотоокисления (ФОП). Существует точка зрения, что ФОП могут вносить вклад в терапевтическое действие ПУВА [3]. Было показано, что продукты ФОП обладают иммуносупрессорными свойствами [4] и оказывают терапевтическое действие при лечении атопической экземы [5]. Однако иммунные и терапевтические механизмы действия этих продуктов остаются предметом дискуссии. Удобной моделью для изучения иммунотропных препаратов, направленных на супрессию гиперреактивного Т-клеточного звена иммунного ответа, является реакция контактной чувствительности (КЧ) к различным гаптенам у мышей. Данная реакция является экспериментальным аналогом аллергического контактного дерматита у человека [6]. Развитие реакции КЧ опосредуется специфическими Т-лимфоцитами и протекает в две фазы (стадии): афферентную (сенсибилизации) и эффекторную (разрешения) [7]. Стадии сенсибилизации и разрешения реакции КЧ развиваются после первичного и вторичного контакта организма с антигеном соответственно. Ранее нами было показано [8], что введение ФОП per os или внутривенно мышам приводит к антигенспецифической супрессии реакции КЧ. Настоящая работа посвящена изучению иммунных механизмов супрессорного действия ФОП. Материалы и методы Приготовление предварительно облученного псоралена (ФОП). Рабочий раствор содержал 0,1 мМ псоралена в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) с 1% этанола. Данный раствор облучали при температуре 4оС УФА-светом лампы Black Light ("Osram", Германия), излучающей преимущественно при 365 нм. Интенсивность света (измеренная с помощью калиброванного фотоэлемента Power Meter 1815-c, Newport 818-UV, США) составляла 23 Вт/м2, доза облучения — 48 кДж/м2. В опытах использовали мышей линии СВА-H2k (самцы массой 18—20 г, возраст 8—10 нед), содержавшихся на стандартном пищевом рационе, со свободным доступом к воде и пище. Животных сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора динитрофторбензола (ДНФБ) в ацетоне. Спустя 24, 96, 120 и 144 ч после сенсибилизации выделяли паховые лимфатические узлы, и после стандартной процедуры щадящей гомогенизации в охлажденной среде RPMI-1640 (содержащей 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) получали суспензии клеток. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Для удобства подсчета ядросодержащих клеток эритроциты лизировали 3% уксусной кислотой. Для оценки пролиферации лимфоцитов суспензию клеток лимфатических узлов, полученных от ДНФБ-сенсибилизированных мышей, засевали в 96-луночный круглодонный планшет в конечной концентрации 106 клеток на лунку в полной среде RPMI-1640, содержащей антибиотик гентамицин в концентрации 80 мкг/мл, 10% инактивированную телячью сыворотку, 2 мМ L-глутамин и 10 мМ Хепес-буфер pH 7,2. Клетки инкубировали 24 ч при температуре 37˚С и 5% CO2. За 6 ч до окончания культивирования в лунки добавляли радиоактивную метку 3Н-тимидин (конечная концентрация в лунке 1 мкКю/мл). По истечении времени инкубации клетки из лунок собирали на автоматическом сборщике клеток, перенося радиоактивный материал на стеклянно-волокнистые фильтры типа HA-930 ("Whatmann", Великобритания). Высушенные фильтры помещали во флаконы из кварцевого стекла, содержащие по 4 мл сцинтилляционного раствора — 4 г 1-4-ди(5-фенил)-2-оксазолил бензола — PPO и 0,1 г 2,5-дифенилоксазола — POPOP на 1 л толуола. Радиоактивность включенного 3Н-тимидина подсчитывали на счетчике β-частиц. Результаты выражали в количестве импульсов в минуту. Оценка уровня секреторных цитокинов. Мышей двукратно, с интервалом 24 ч, сенсибилизировали ДНФБ (1-й и 2-й дни). На 2-й день и еще через сутки (3-й день) мышам опытных групп внутривенно (в/в) или перорально вводили 0,5 мл ФОП или необлученного псоралена. Животным контрольной группы на 2-й и 3-й дни вводили 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. Через 3—4 ч после последнего введения тестируемого агента выделяли паховые лимфатические узлы мышей и готовили суспензии клеток. 106 клеток лимфатических узлов культивировали 24 или 48 ч в присутствии 15 мкг/мл конканавалина А в 96-луночных планшетах при 37°C и 5% CO2 в полной среде RPMI-1640. После культивирования методом цитофлюориметрического анализа оценивали внеклеточные концентрации цитокинов согласно инструкции к набору реактивов Mouse Th1/Th2 FlowCytomix Multiplex ("Bender MedSystems", Австрия). Цитокиновый профиль определяли с помощью проточного цитофлюориметра Cytomics FC-500 ("Beckman Coulter", США) и программного обеспечения FlowCytomix Pro ("Bender MedSystems", Австрия). В контрольных пробах пиковые концентрации цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-γ наблюдались через 24 ч, а ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-5, ИЛ-6, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и ФНО-α — через 48 ч культивирования. В дальнейших сериях экспериментов концентрации вышеуказанных секреторных цитокинов определяли именно через то время культивирования (24 или 48 ч), когда они должны были достигать своего максимального уровня. ИЛ-1 ни в одной из 3 серий экспериментов не детектирован. Оценка апоптоза. Мышей сенсибилизировали ДНФБ и через 24 ч готовили суспензии паховых лимфатических узлов. К суспензиям, содержащим 5 • 106 клеток в ФБР, добавляли различные объемы ФОП таким образом, чтобы конечный объем пробы составлял 2 мл и конечные концентрации по псоралену до его облучения составляли 10-6, 10-5 или 5 • 10-5 М. Инкубацию суспензий проводили в течение 15 мин при температуре 37°C и 5% CO2. В контрольной пробе (К+) 5 • 106 клеток в 2 мл ФБР инкубировали в присутствии 1% этанола. Для определения апоптотической активности необлученного псоралена к суспензии, также содержащей 5 • 106 клеток в ФБР, добавляли 1 мл необлученного агента в концентрации 10-4 М (конечная концентрация составляла 5 • 10-5 М). После инкубации суспензии клеток троекратно отмывали в среде RPMI-1640 путем центрифугирования (5 мин, 400 g). Затем удаляли супернатант и осадок, содержащий клетки лимфатических узлов, культивировали в полной среде RPMI-1640 при 37°C и 5% CO2 в течение 4 или 18 ч. После культивирования 5 • 105 клеток были помечены аннексином-V и йодистым пропидием (An/Pi) согласно инструкции к набору реагентов. Дабы избежать "температурного" апоптоза, все манипуляции, с момента завершения культивирования вплоть до постановки пробы в цитофлюориметр, проводили при 4оС. В область (гейт) анализа включали все события, за исключением дебриса. Долю AnV+-клеток (ранний апоптоз), AnV+/Pi+-клеток (поздний апоптоз) и Pi+-клеток (некроз) определяли с помощью набора Annexin V-FITC-Pi ("Beckman Coulter", США) по стандартной методике на проточном цитофлюориметре Altra ("Beckman Coulter", США) согласно инструкции производителя. Интенсивность подачи суспензии подбирали таким образом, чтобы скорость сбора к моменту записи данных составляла 300 событий в 1 с. Анализировали 10 000 событий. Статистическую обработку результатов осуществляли методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического значения, стандартного отклонения (σn-1) и стандартной ошибки среднего значения (SEM). Статистическую значимость различий между опытными и контрольными группами определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение Влияние ФОП на динамику клеточности лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Во время афферентной фазы реакции КЧ происходит пролиферация, созревание и накопление пула специфических Т-лимфоцитов в ответ на накожную аппликацию гаптена [7]. Ранее мы установили [9], что ФОП способен подавлять реакцию КЧ на ее афферентной стадии, что указывало на возможность угнетения пролиферации антигенспецифических лимфоцитов под действием ФОП. В связи с этим была поставлена задача изучить, как изменяется количество лимфоцитов в регионарных лимфатических узлах ДНФБ-сенсибилизированных мышей после введения ФОП. Для этого через 24, 96, 120 и 144 ч после сенсибилизации мышей ДНФБ выделяли паховые лимфатические узлы животных и подсчитывали в них абсолютное количество ядросодержащих клеток (группа положительного контроля, К+). В опытной группе мышам вводили перорально по 0,5 мл раствора ФОП через 24 ч после сенсибилизации ДНФБ. В группе положительного контроля К+ вместо ФОП перорально вводили по 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. В качестве отрицательного контроля (К‑) была выбрана группа интактных мышей, у которых оценивали абсолютное количество клеток в паховых лимфатических узлах. На рис. 1 видно, что абсолютное количество клеток в лимфатических узлах сенсибилизированных мышей (положительный контроль К+, сплошная кривая) увеличивалось в 6 раз через 96 ч после сенсибилизации. На 6-е и 7-е сутки количество клеток уменьшалось. Увеличение клеточности лимфатических узлов было обусловлено, согласно данным литературы [7], пролиферацией, дифференцировкой и созреванием в лимфатических узлах клона антигенспецифических Т-лимфоцитов. Затем, через 120 ч после сенсибилизации, количество клеток в лимфатических узлах уменьшалось, что, по-видимому, было обусловлено миграцией лимфоцитов из лимфатических узлов в кровоток, а затем — в ткани организма животного [10]. Также видно (см. рис. 1), что введение ФОП мышам приводило к уменьшению клеточности лимфатических узлов сенсибилизированных ДНФБ мышей (пунктирная кривая). Через 96 ч после сенсибилизации в лимфатических узлах мышей, получивших ФОП, содержалось меньше клеток, чем в положительном контроле (К+): 19,2 ± 3,1 • 106 и 31,3 ± 0,8 • 106 клеток на лимфатический узел соответственно (p < 0,05). Представленные данные указывают на то, что введение мышам ФОП могло приводить либо к угнетению пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов, как это показано для ПУВА-воздействия [9], либо к апоптозу клеток лимфатических узлов. Введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам приводило к увеличению клеточности лимфатических узлов через 120 и 144 ч по сравнению с положительным контролем (см. рис. 1). Такая динамика может свидетельствовать о том, что использованный нами агент, по-видимому, угнетает миграцию антигенспецифичных Т-клеток из лимфатических узлов в кровоток в конце афферентной фазы развития реакции КЧ [7]. Измерение пролиферативной активности клеток лимфатических узлов под действием ФОП in vivo. В следующей серии экспериментов мы оценили влияние ФОП in vivo на пролиферативную активность клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Для этого мышей дважды сенсибилизировали ДНФБ на 1-е и 2-е сутки. Через 24 и 44 ч с момента первой сенсибилизации 0,5 мл ФОП или необлученного псоралена вводили мышам в/в или перорально. Через 72 ч с момента первичной аппликации ДНФБ получали суспензию клеток лимфатических узлов, культивировали в течение 24 ч и оценивали пролиферативную активность клеток. Введение мышам необлученного псоралена не влияло на пролиферативную активность клеток лимфатических узлов (рис. 2). При этом как внутривенное, так и пероральное введение ФОП мышам приводило к снижению пролиферативной активности клеток лимфатических узлов на 22 ± 2,4% (p < 0,03) и 16 ± 4,9% (p < 0,05) соответственно по сравнению с контролем. Таким образом, введение ФОП мышам приводило к снижению пролиферативной активности клеток лимфатических узлов. Цитокиновый профиль клеток лимфатических узлов в реакции КЧ под действием ФОП. Известно, что супрессорное действие многих агентов на реакцию КЧ, включая ПУВА-воздействие, может быть следствием регуляции цитокинового профиля иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в развитии КЧ [11]. Поэтому мы изучили влияние ФОП in vivo на продукцию секреторных цитокинов клеток лимфатических узлов на афферентной фазе развития реакции КЧ. Мыши были дважды сенсибилизированы ДНФБ на 1-е и 2-е сутки. ФОП или необлученный псорален вводили мышам в/в или перорально на 2-е (48 ч) и 3-и (72 ч) сутки с момента первичной сенсибилизации. Через 72 ч с момента первичной аппликации ДНФБ получали суспензию клеток лимфатических узлов. Суспензию клеток в полной среде культивировали в присутствии конканавалина А в течение 24 или 48 ч. Согласно полученным данным, уровни ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ГМ-КСФ и ФНО-α в опытных группах (получивших ФОП или псорален) статистически значимо не отличались от таковых в контрольных группах. Однако введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам приводило к уменьшению продукции таких цитокинов, как ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-γ, по сравнению с контрольной группой (К+) на 16,3, 39,1 и 38% при его в/в введении и на 40,8, 53,7 и 51,6% при пероральном. Секреция клетками ИЛ-17 под действием ФОП увеличивалась при в/в введении на 33,3%, при пероральном на 40,7% по сравнению с положительным контролем. Необлученный псорален не влиял на профиль цитокинов клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей (рис. 3). Индукция апоптоза сенсибилизированных клеток лимфатических узлов продуктами фотоокисления псоралена in vitro. Нами была проведена оценка проапоптотической активности ФОП in vitro. Для этого в суспензию клеток лимфатических узлов, выделенных спустя 24 ч после сенсибилизации мышей ДНФБ, добавляли ФОП таким образом, чтобы конечная концентрация по псоралену до его облучения составляла 10-6 М, 10-5 М или 5 • 10-5 М. Концентрация необлученного псоралена в суспензии клеток всегда составляла 5 •10-5 М. Процент апоптотических клеток определяли путем суммирования An-положительных (An+Pi-, ранний апоптоз) и AnPi-положительных (An+Pi+, поздний апоптоз) клеток (событий) в каждой группе и последующего их сравнения с группой положительного контроля. Разность между группой положительного контроля и опытными группами расценивали как долю апоптотических клеток в последних. На рис. 4 видно, что необлученный псорален in vitro как через 4 ч (а), так и через 18 ч (б) культивирования не влиял на процент погибших (в том числе через механизм апоптоза) клеток. Однако добавление ФОП in vitro к суспензиям клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей в концентрациях 10-5 М и 5 • 10-5 М через 4 ч культивирования увеличивало количество погибших через апоптоз лимфоцитов на 6 и 16% соответственно по сравнению с контролем (p < 0,05). Через 18 ч прирост апоптотических клеток в вышеуказанных пробах составлял 2,5 и 15% соответственно по сравнению с положительным контролем (p < 0,05). Также нами было показано, что добавление ФОП in vitro в концентрации 10-6 М к суспензиям клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных животных не влияло на количество погибших клеток как через 4 ч, так и через 18 ч культивирования по сравнению с положительным контролем. В настоящей работе обнаружено, что пероральное введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам вызывало уменьшение количества клеток в лимфатических узлах (см. рис. 1). Известно, что на афферентной фазе развития реакции КЧ происходит пролиферация и накопление пула специфических Т-лимфоцитов [7], поэтому вышеуказанное действие ФОП могло быть следствием подавления их пролиферации либо индукции в них апоптоза [9, 12]. Действительно, нами установлено снижение пролиферативной активности клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей, получивших ФОП, независимо от способа его введения (перорально или в/в, рис. 2). Также было показано (см. рис. 3), что такое снижение пролиферации имеет под собой цитокиновую природу, заключающуюся в том, что ФОП обладает модулирующим влиянием на продукцию секреторных цитокинов клетками лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей. ФОП снижал продукцию ИЛ-2 лимфоцитами — Th1-цитокина, который, по данным литературы [7], ответствен за усиление пролиферации иммунокомпетентных клеток при развитии реакции КЧ. Также было показано, что ФОП подавляет секрецию лимфоцитами таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-4 и ИФН-γ, тем самым свидетельствуя о возможности использованного нами агента нарушать процесс дифференцировки CD8+-лимфоцитов (ведущих реакцию КЧ при использовании ДНФБ в качестве сенсибилизатора [13]) в Тс1- и Тс2-субпопуляции. Увеличение секреции провоспалительного цитокина ИЛ-17 может говорить о том, что ФОП вызывает переключение иммунного ответа, а именно: блокирует формирование Th1- и Th2-ответа, стимулируя образование Th17-лимфоцитов [14]. Известно, что при добавлении ФОП, полученного при облучении очень концентрированного раствора псоралена (2,7 мМ), к опухолевой Т-клеточной линии Jurkat наблюдается генерация апоптотических клеток [12]. Кроме того, по данным литературы [15], известны агенты, способные подавлять реакцию КЧ путем одновременного подавления пролиферации Т-эффекторных лимфоцитов и индукции апоптоза последних. Таким образом, другим механизмом супрессорного действия ФОП могла стать индукция апоптоза эффекторных клеток (созревающих Т-лимфоцитов), принимающих участие в развитии иммунного ответа в реакции КЧ. Действительно, нами было показано, что обработка in vitro клеток лимфатических узлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей раствором ФОП, полученным при фотоокислении 0,1 мМ раствора псоралена и разбавленного затем в 100 раз фосфатно-солевым буферным раствором (что сравнимо с концентрацией ФОП в кровотоке животных при его введении per os или в/в), через 4 ч культивирования на 13% по сравнению с ДНФБ-сенсибилизированным контролем повышает процент апоптотических клеток. Необходимо отметить, что раствор ФОП представляет собой сложную смесь фотопродуктов [4, 12]. Таким образом, на данный момент неясно, являются ли вышеприведенные иммунологические эффекты результатом действия лишь одного фотопродукта либо за индукцию апоптоза и ингибирование пролиферации Т-клеток ответственны различные продукты фотоокисления псоралена. Проапоптотическая активность ФОП in vivo (при введении данного агента мышам per os через 24 ч после сенсибилизации ДНФБ) нами не отмечена (данные не приведены). Таким образом, можно предположить, что механизмами действия продуктов фотоокисления псоралена являются как модуляция цитокинового профиля иммунокомпетентных клеток, приводящая в свою очередь к снижению пролиферативной активности лимфоцитов-эффекторов, так и индукция апоптоза Т-эффекторов.

About the authors

Ilya Alekseevich Pyatnitsky

N.I.Pirogov National Research Medical University

Svetlana Ivanovna Pavlova

D. Rogachev Federal Research and Clinical Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology; I.N.Ulyanov Chuvash State University

Diana Zaurbekovna Albegova

N.I.Pirogov National Research Medical University

Ivan Genrihovich Kozlov

N.I.Pirogov National Research Medical University; D. Rogachev Federal Research and Clinical Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology

Aleksandr Yakovlevich Potapenko

N.I.Pirogov National Research Medical University

Alla Anatolievna Kyagova

N.I.Pirogov National Research Medical University

Email: kyagova.alla@gmail.com

References

Supplementary files