Clinical characteristics of cutaneous and mucosal melanoma and c-KIT gene L576P mutation

Full Text

Рецептор c-KIT, известный также как рецептор тирозинкиназы, или CD117, представляет собой трансмембранный белок с тирозинкиназной активностью. Он является белком семейства тирозинкиназ типа III и играет важную роль в поддержании жизнеспособности клеток, принимает участие в регуляции пролиферации, роста, развития и дифференцировки клеток, а также в формировании гамет и образовании меланина [1, 2]. Рецептор с-KIT широко распространен в гематопоэтических клетках, стволовых клетках, клетках зародыша, тучных клетках, а также меланоцитах. Белок c-KIT был обнаружен в 1987 г. как протеин, гомологичный вирусному онкогену v-KIT, выделенному в 1986 г. из ретровируса кошачьей саркомы HZ4 [3]. Дальнейшие исследования данного белка показали его участие в важных путях передачи сигнала в клетке [4]: PI3 сигнальный путь связан с ангиогенезом тканей и выживаемостью клеток [5], PLC-y сигнальный каскад обеспечивает пролиферацию выживание клеток, SRC - регулирует одновременно выживаемость клеток, их пролиферацию и подвижность [6], JAK/STAT-механизм передачи сигнала вовлечен в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [7], а сигнальный путь RAS/ERK осуществляет контроль за миграцией, ангиогенезом и пролиферацией клеток [8]. Именно эти важнейшие клеточные процессы оказываются измененными при развитии злокачественных новообразований. Ген c-KIT располагается в длинном (q) плече 4- й хромосомы, в положении 11-12 и является эво- люционно высоко консервативным. Протяженность гена составляет 90 тыс.п.о., он включает 21 эк- зон, а молекулярная масса кодируемого им белка - 145 кД [4]. При этом белок подразделяют на три основных домена: внеклеточный домен, обеспечивающий присоединение лиганда и состоящий из пяти иммуноглобулиноподобных доменов D1-D2-D3-D4-D5 (экзоны 2-9), трансмембранный домен (экзон 10) и внутриклеточный домен, включающий в себя два малых домена - околомембранный (juxtamembrane domen - JM-домен) и тирозинкиназный. Передача сигнала осуществляется при активации рецептора путем связи лиганда SCF с участком внеклеточного домена D1-D3. Это приводит к димеризации белка в регионе D4-D5, аутофосфорилированию рецептора и запуску связанных сигнальных путей. Исследования показали, что на функционирование рецептора c-KIT оказывают влияние мутации в кодирующем его гене. При этом наиболее мута- бельными признаны домены D4-D5 (экзоны 8 и 9), JM-домен (экзон 11) и тирозинкиназный (экзон 17). В этих регионах отмечают различные типы мутаций: делеции, инсерции, однонуклеотидные замены. Одни из них могут приводить к утрате функции рецептора тирозинкиназы, проявляясь в виде нарушений пигментации, другие приводят к постоянной активации рецептора, не требующей лиганда, что влечет за собой непрерывный рост и пролиферацию клеток [4]. Именно эти мутации становятся особенно важными при развитии опухолей. Показано, что около 95% опухолей пищеварительного тракта проявляют повышенную экспрессию c-KIT, при этом от 20 до 80% этих случаев вызвано наличием мутаций в гене [2]. Экспрессия c-KIT встречается у 68% больных острым миелолейкозом, у 80% - в периоды обострения хронического миелолейкоза. При этом экспрессия коррелирует со сниженной выживаемостью больных, сокращая шансы на выздоровление [9, 10]. Участие с-KIT в образовании меланина связано с биологией меланоцитов и развитием меланомы. Меланома состоит из нескольких молекулярных подтипов, каждый из которых может обладать уникальными свойствами, комплексом мутаций и по-разному реагировать на одинаковую терапию [11]. Согласно результатам исследований [12], около 36% первичных меланом положительно окрашиваются иммуногистохимически на c-KIT и, как правило, это обусловлено наличием мутаций в гене. Охарактеризован ряд мутаций гена c-KIT, имеющих влияние на течение меланомы. При этом показано, что активирующие мутации в данном гене чаще всего встречаются в увеальных, акрально-лентиги- нозных меланомах, меланомах слизистых и меланомах, возникающих на открытых участках кожи. Одним из наиболее подверженных мутациям считают 11-й экзон гена, кодирующий JM-домен. В нем обнаруживают мутации 1669T>C (W557R), 1674G>C (K558N), 1676T>C (V559A), 1676T>A (V559D), 1696A>G (N566D), 1706T>G (V569G), 1727T>C (L576P) [12]. В большей степени они способствуют активации рецептора без участия лиганда, что приводит к непрерывному неконтролируемому росту и пролиферации клеток, уклонению от апоптоза и миграции. При этом показано, что наличие мутаций может способствовать повышенной чувствительности меланомы к терапии препаратами - ингибиторами тирозинкиназ, таким как иматиниб, дазатиниб, суни- тиниб, сорафениб [12-14]. Одной из наиболее часто встречаемых и перспективных для изучения мутаций в клетках меланомы считается однонуклеотидная замена T1727C, располагающаяся в 11-м экзоне гена и приводящая к аминокислотной замене L576P на участке белка, формирующем околомембранный JM-домен внутри клетки. Частота встречаемости данной мутации в клетках меланомы составляет 25-29% от всех KIT-мутаций и до 44% - от мутаций в 11-м экзоне [15]. При этом максимальная ее встречаемость приходится на акрально-лентигинозную меланому слизистых. Позднее было выявлено, что меланома кожи при локализации на участках тела, подверженных хроническому воздействию УФ-излучения, также характеризуется сравнительно высоким процентом встречаемости мутации L576P. На сегодняшний день известно, что данная мутация приводит к значительному повышению уровня экспрессии KIT [15], и в то же время мутантные клетки проявляют высокую чувствительность к терапии специфическими киназными ингибиторами [16, 17], обеспечивая благоприятный прогноз и повышая шансы на ремиссию. Целью настоящего исследования было определение мутации L576P в 11-м экзоне гена c-KIT у больных меланомой кожи и слизистых, проведение анализа связи прогностических клинико-патоморфологических признаков меланомы с наличием вышеуказанной мутации. Материалы и методы Исследование утверждено локальным этическим комитетом и проведено на кафедре патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии им. проф. В.В. Иванова ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенец- кого Минздрава России. В работе использованы биоптаты меланомы (n = 19), фиксированные формалином и заключенные в парафиновые блоки. Биоптаты были предоставлены ГБУЗ Красноярское краевое патолого-анатомическое бюро (Красноярск). Рис. 2. Гистологическая картина акрально-лентигинозной меланомы кожи. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100. Рис. 1. Акрально-лентигинозная меланома первого пальца стопы. Для выделения геномной ДНК проводили депарафи- низацию ткани с помощью ксилола с последующей двукратной отмывкой этанолом. Для дальнейшего выделения ДНК использовали комплект реагентов ДНК-сорб В («НекстБио», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Очищенную ДНК элюировали 50 мкл TE-буфера и хранили при температуре -20°С. Перед аллельспецифичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли проведение контрольной реакции ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для оценки качества образца. Кроме того, учитывая мутабель- ность 11-го экзона, данный этап позволял исключить возможность отсутствия реакции из-за наличия мутаций в области посадки праймеров. Для постановки реакции использовали праймеры и зонд, не затрагивающие мутацию L576P (T1727C), но покрывающие те же участки гена, что и аллельспецифичные праймеры. Для постановки реакции использовали реакционную смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX («Синтол», Россия). Реакцию осуществляли на приборе StepOne™ ("Applied Biosystems", Сингапур). Подходящими для аллельспецифичной ПЦР считали образцы с Ct не более 33. Положительными, т.е. имеющими мутацию L576P, считали образцы, у которых отмечен положительный флюоресцентный сигнал в реакции с праймерами, комплементарными мутантной ДНК. В качестве положительного контроля реакции использовали искусственно синтезированные фрагменты ДНК, клонированные в плазмиду pAL2-TA («Евроген», Россия). Гистологические препараты меланомы кожи толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Далее при помощи оптического микрометра измеряли толщину опухолевого узла (в миллиметрах). Замеры проводили от шиповатого слоя эпидермиса до нижней границы опухоли строго перпендикулярно ее поверхности. Все измерения производили при увеличении х400 с помощью микроскопа Olympus BX-41 с видеонасадкой Olympus u-CMAD3 и программного обеспечения Infinity Capture ("Lumenera Corporation", Канада). По шкале Бреслоу все опухоли разделили на четыре класса: I - 1 см и менее («тонкие меланомы»); II - 1-2 см; III - 2-4 см; IV - 4 см и более («толстые меланомы»). Оценку изъязвления опухоли проводили на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Изъязвлением считали отсутствие эпидермиса над опухолью. При этом эрозирование поверхностности ткани с сохранением части слоев эпидермиса не расценивали как изъязвление. В дальнейшем результат оценивали как наличие или отсутствие изъязвления. Степень пигментации меланомы проводили на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Степень пигментации первичной меланомы расценивали в баллах: 0 баллов (беспигментная меланома) - при данном типе наблюдается отсутствие пигмента в клетках опухоли; 1 балл (слабопигментированная меланома) - определяются единичные гранулы пигмента в опухоли; 2 балла (среднепигментированная) - гранулы пигмента в 1А всех полей зрения; 3 балла (значительно пигментированная) - гранулы пигмента более 1А всех полей зрения, но не во всех полях зрения; 4 балла (резкопигментированная) - гранулы пигмента в каждом поле зрения. Определение оценки лимфоцитарной инфильтрации проводили на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Для оценки характера статуса лимфоцитарного инфильтрата TILs (Tumor-Infiltrating Lymphocytes) определяли следующие параметры: характер, плотность и распределение TILs. Оценку TILs проводили полуколиче- ственным способом. Характер TILs определяли соответственно следующим критериям: Brisk-лимфоциты диффузно инфильтрируют всю ткань опухоли или находятся в основании опухоли; Non-brisk-лимфоциты инфильтрируют опухолевую ткань фокально (образуют отдельные очаги); Absent-лимфоциты отсутствуют, либо присутствуют, но не проникают в опухоль. Интенсивность (плотность) лимфоцитарного инфильтрата расценивали как выраженную (плотный инфильтрат), умеренную либо скудную. Статистически обрабатывали результаты с помощью /2 и критерия Манна-Уитни. Результаты и обсуждение Для оценки частоты встречаемости мутации L576P в 11-м экзоне гена c-KIT были исследованы 19 биоптатов первичной меланомы с локализацией на участках тела, подверженных хроническому воздействию УФ-излучения (лицо, верхние конечности, а также нижние конечности у лиц женского пола). Помимо этого, идентификацию мутаций осуществляли у пациентов с акрально-лентигинозной меланомой (рис. 1), а также меланомой слизистых оболочек. Мутация L576P выявлена у 3 (16%) из 19 пациентов. Все L576P-положительные опухоли имели локализацию в области предплечий. Анализ распределения пациентов по возрасту в зависимости от мутационного статуса не выявил различий между сравниваемыми группами. Далее оценивали корреляцию между наличием вышеуказанной мутации у пациента и прогностическими факторами меланомы (толщина опухоли по Бреслоу, характер интраопухолевого лимфоцитарного инфильтрата, наличие пигмента, изъязвления) на основе морфологического исследования гистологических препаратов (рис. 2). Не выявлено связи между вышеуказанными прогностическими факторами и мутационным статусом по L576P. Является установленным фактом роль c-KIT- опосредованного сигналлинга в развитии и прогрессии меланомы. С помощью иммуногистохимических исследований выявлено, что c-KIT высоко экспрессируется в нормальных меланоцитах и доброкачественных меланоцитарных новообразованиях кожи [18]. При этом уровень его экспрессии снижается при меланоме и коррелирует со степенью прогрессии опухоли. Помимо этого, недавние исследования определили [19], что при меланоме наблюдаются эпигенетические изменения в промоторе гена c-KIT. Интенсивность метилирования показывала обратную связь с активностью промотора и не была связана с наличием каких-либо других изменений в таких хорошо известных молекулярных драйверах опухоли, как BRAF, NRAS, TP53, PTEN, INK4A (p16), ARF (p 14), CCND1, MYC, CDK4, MITF [19]. Ранее мы провели анализ клинико-морфологических особенностей BRAF-позитивной меланомы кожи [20], который показал, что BRAF-позитивные меланомы кожи определяются у пациентов более молодого возраста, а также в опухолях с локализацией в области туловища. В проведенном пилотном исследовании прослеживается аналогичная тенденция - отсутствие связи с какими-либо прогностическими факторами меланомы, изменение механизмов внутриклеточной сигнализации в результате мутации в онкогене, специфическая превалирующая локализация опухоли, в случае мутации в гене c-KIT - в области ладоней, подошв, слизистых и на участках кожи, подверженной хроническому воздействию УФ-излучения. Стоит отметить, что основной целью идентификации мутаций при меланоме кожи является последующий выбор специфической противоопухолевой терапии на основе персонализированного подхода, на основе молекулярного подтипа опухоли. Дальнейшие исследования необходимы с целью разъяснения специфичных механизмов развития опухоли при каждом отдельном молекулярном подтипе опухоли. При этом оценка прогностической значимости, выявление характера течения заболевания в зависимости от мутационного статуса опухоли является, на первый взгляд, недостаточной для молекулярногенетического «портрета» опухоли, что не отрицает иных различий между молекулярными подтипами меланомы, в отношении которых прогностическая значимость требует дальнейших исследований.

About the authors

A. V Komina

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: komivlann@yandex.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

M. B Aksenenko

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

N. V Palkina

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: mosmannv@yandex.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

A. V Motorina

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: kozlovaa.v@mail.ru
660022, Krasnoyarsk, Russia

Tatiana G. Ruksha

V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: tatyana_ruksha@mail.ru
MD, PhD, DSc 660022, Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files