Фенотипическая изменчивость влагалищных трихомонад как причина устойчивости к метронидазолу

Полный текст

Актуальным вопросом ведения больных мочеполовым трихомониазом (МТ) является неэффективность лечения метронидазолом. Вопрос о чувствительности штаммов Trichomonas vaginalis неоднократно рассматривали раньше, обсуждают его и в настоящее время. Мнения различных авторов по этому вопросу противоречивы: одни полагают, что неэффективность лечения обусловлена появлением высокорезистентных к метронидазолу штаммов влагалищных трихомонад, другие видят причину в нерационалъных схемах лечения. При этом предполагают, что в эпидемическом процессе имеют значение малосим- птомные, вялые формы болезни, а также трихомонадоно- сительство. При этом, как правило, отсутствуют признаки воспаления, а возбудитель выявляется при рецидивах воспалительных заболеваний у одного из половых партнеров. Трихомонадоносительство способствует эпидемиологическому распространению возбудителя среди половых партнеров. Частота носительства T.vaginalis по данным различных авторов составляет среди женщин 10-35%, а среди мужчин - 2-41% [1-3]. Отмечено, что штаммы простейших, выделенных от уже леченных метронидазолом больных, обладают большей устойчивостью и выдерживают in vitro сублетальные дозы более длительно, чем штаммы влагалищных три- хомонад, выделенные от больных, не получавших ранее лечение. Эффективность терапии зависит не только от биологических свойств микроорганизма, но и от концентрации препарата в сыворотке крови, тканях, скорости его выведения из организма, дозировки лекарственного средства, методики его применения [4-8]. За время использования метронидазола разработано множество схем его применения. Большинство из них неизменно было направлено на увеличение разовых и курсовых доз препарата, что и обусловило катастрофическое нарастание устойчивости T.vaginalis к метронидазолу [9, 10]. Выявлены высокорезистентные штаммы влагалищных трихомонад, у которых уровень чувствительности к метронидазолу варьирует в широких пределах [8, 10-13]. Несмотря на относительно малые размеры, T. vaginalis имеет весьма сложную морфологию и не менее сложный метаболизм. Однако некоторые авторы отмечают, что размеры урогенитальной трихомонады весьма вариабельны и зависят от стадии заболевания, темпов роста, особенностей штамма. A. Kraus [14] полагает, что величина три- хомонад зависит и от стадии заболевания: мелкие особи (8-10 мкм) чаще находят при остром заболевании, крупные (до 30-45 мкм) - при хроническом. Фенотип клетки меняется в зависимости от физикохимических условий среды и фазы роста [3]. Когда трихо- монада прикрепляется к клетке хозяина, она приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки [15], что свидетельствует о значительной модификационной изменчивости T. vaginalis, выполняющей функцию адаптации. Дискутируется вопрос о том, могут ли T. vaginalis кроме активно движущейся с помощью ундулирующей мембраны трофозоидной формы иметь другие фенотипы, в частности неподвижные, безжгутиковые (амастиготные). У эндопаразита окружающая среда может резко меняться на протяжении очень короткого срока (срабатывают механизмы гомеостаза), в связи с чем и процессы изменчивости паразита ускоряются до величин, не встречающихся у свободно живущих организмов. Особенно это заметно по отношению к паразитирующим простейшим, которые могут претерпевать изменения при каждом бесполом размножении. Кроме того, источником наследственной изменчивости в клонах агамных простейших могут быть и механизмы цитоплазматической наследственности [16]. На паразита влияет двоякая среда обитания: среда первого порядка - непосредственно организм хозяина, и среда второго порядка - условия, окружающие хозяина. По данным Э.А. Баткаева, Д.В. Рюмина [17], в течение последних лет среди больных МТ увеличилась частота выявления метаболически малоактивных особей паразита, лишенных органоидов движения (блефаропласта, жгутиков и ундулирующей мембраны). Ранее И.И. Ильин [14] отметил, что у мужчин, чьи жены больны МТ, находят «своеобразные» малоподвижные клетки в нативных препаратах, отличающиеся в окрашенных мазках от «классических» трихомонад и исчезающие после проведения специфической терапии. Многие авторы считают их особой формой трихомонад. К одной из таких атипичных форм относят так называемые «круглые неподвижные формы», обнаруживаемые в нативных препаратах. Считают, что именно эти формы обладают устойчивостью к лекарственным препаратам. «Круглые» формы трихомонад лишены или почти лишены жгутиков и ундулирующей мембраны, но способны к размножению. Одним авторам удалось получить живые типичные культуры при посеве «круглых» форм, другим - нет. Это позволило предположить, что атипичные формы трихомонад являются либо мертвыми клетками, либо особями, вступившими в шизогонию, т.е. множественное деление [18]. Переход трихомонады из одного фенотипа в другой сопровождается одновременной коррелятивной изменчивостью внутреннего строения. Амебовидные трихомонады обладают выраженной фагоцитарной активностью. Предполагают, что эта стадия развития обусловлена активизацией питания и запасанием необходимых для размножения веществ [18]. При этом амебовидные трихомонады обладают выраженной цитотоксичностью по отношению к клеткам хозяина [19]. Круглые, шаровидные трихомонады, размером от 1,5 до 4 мкм, с толстой опалесцирующей оболочкой рассматриваются как почкующиеся или делящиеся особи. Наличие таких форм в мочеполовом тракте затрудняет лечение МТ обычными методами. Задачей настоящего исследования явилось изучение морфологической изменчивости влагалищных трихомо- над под влиянием мутагена нитрозогуанидина, применяемого в биологии для воздействия на геном микроорганизмов и простейших. Материал и методы Нитрозогуанидин (НГ) является одним из самых мощных и широко применяемых мутагенов. Согласно стандартной методике, исходные растворы мутагена готовят непосредственно перед использованием, растворяя его в соответствующем буфере (0,1М нитратный буфер, рН 5,5) до концентрации 1 мг/мл. Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50-500 мкг/мл. Для воздействия на трихомонады, рабочую концентрацию мутагена получали путем разведения мутагена с помощью ацетатного буфера (рН 7,4) или питательной среды для выращивания трихо- монад. Суточную культуру трихомонад с признаками обильного роста (трихомонады в контрольной капле на предметном стекле покрывали все поле зрения) осаждали центрифугированием, промывали буферным раствором в количестве 5 мл (3 раза). После осаждения культуру в количестве 1 мл вносили в 5 пробирок, содержащих по 5 мл питательной среды для выращивания три- хомонад. Первая пробирка (контроль) - без мутагена, в остальные вносили мутаген в концентрациях 50, 100, 150, 500 мкг/мл и инкубировали 15 мин при температуре 37 °С. После инкубации культуру вновь осаждали центрифугированием (1000 об/мин) и отмывали фосфатным буфером в количестве 5 мл 3 раза. После удаления буфера к осадку добавляли питательную среду для выращивания трихомонад в количестве 5 мл и оставляли в термостате при температуре 37°С на ночь. Культуру простейших оценивали ежедневно микроскопией нативного препарата со спущенным конденсором (окуляр 10, объектив 40, увеличение 400). Согласно стандартной методике для эксперимента отбирали культуру трихомонад, в которой выживаемость простейших составляла примерно 50%. Пригодную для эксперимента культуру распределяли тонким слоем по поверхности предметного стекла, высушивали на воздухе при комнатной температуре и окрашивали красителем для быстрого окрашивания по методу Романовского (Лейкодифф, «Лахема»). Показателем прекращения просмотра мутированных образцов являлась полная гибель простейших. Результаты Разнообразие морфотипов T.vaginalis под влиянием мутагена. а - трихомонада без аксостиля; б - трихомонады с измененными ядрами без аксостиля; в - овальная форма трихомонады с измененным ядром; г - деление влагалищной трихомонады почкованием; д - безжгутиковые формы влагалищных трихомонад; е - полиморфизм влагалищных трихомонад. Отдельно лежащие жгутики. Под влиянием мутагена в течение 15 и 30 мин наблюдалось образование колоний простейших по 50-100 особей в каждой. При этом отмечена своеобразная ориентация трихомонад: головной конец с активно движущимися жгутиками располагался снаружи. Наблюдался выраженный полиморфизм простейших: помимо типичных грушевидных форм трихомонад в колониях присутствовали круглые и овальные особи, содержащие в протоплазме обилие питательных частиц, а также мелкие, крупные и гигантские. Иногда наблюдались необычные удлиненные формы простейших. В центре колоний, как правило, располагались крупные трихомонады, а вокруг мелкие, фиксированные ши- пиками к поверхности крупных особей. Живые трихомонады нередко были в одной колонии с мертвыми. У округлых форм трихомонад часто наблюдался дефект опорного аппарата - аксостиля. Помимо особей с обычным аксостилем, заканчивающимся шипиком, в препаратах встречались простейшие с укороченным, изогнутым аксостилем или без него (см. рисунок, а, б). Иногда наблюдались округлые безжгутиковые формы трихомонад, лишенные аксостиля. По мере увеличения продолжительности инкубации трихомонад с мутагеном, в культуре увеличивалось число единичных свободнодвижущихся простейших, уменьшалось их количество в колониях, увеличивался полиморфизм. Преобладали овальные морфотипы простейших (см. рисунок, в). Отмечены единичные многоядерные трихомонады с множественными жгутиками на поверхности мембраны и безъядерные особи. Движения жгутиков медленные. У некоторых особей отмечено образование вакуолей в протоплазме и возникновение каплевидных образований на поверхности (см. рисунок, г). Иногда единичная круглая вакуоль занимала почти все внутреннее пространство простейшего. Через 24 ч от момента введения мутагена в культуру наблюдалось активное движение простейших (толчкообразные движения по прямой, вращение по часовой и против часовой стрелки). Характерно активное толчкообразное выбрасывание жгутиков и притягивание с их помощью плавающих в растворе эпителиальных клеток и питательных частиц. У шаровидных форм трихомонад отмечены медленные движения жгутиков. Изменялся тип движения простейших - от характерных толчкообразных до маятникоподобных. В случае наличия в питательной среде эпителиальных или дрожжеподобных клеток или нитей мицелия наблюдалась фиксация трихомонад на их поверхности. При этом обращали на себя внимание гигантские формы дрожжеподобных клеток по сравнению с контролем. Под влиянием мутагена простейшие активно поглощали питательные частицы из окружающей среды. В отличие от «классической» удлиненной формы в виде косточки сливы, в эксперименте наблюдались простейшие с измененной формой ядра: округлым, овальным, удлиненным, изогнутым. Иногда в ядре наблюдались округлые полости. В экспериментальных образцах помимо одноядерных особей наблюдались двухъядерные и многоядерные формы трихомонад. Отмечены единичные многоядерные особи с множественными жгутиками на поверхности мембраны и безъядерные формы. В контрольном образце трихомонады располагались, как правило, вокруг эпителиальных клеток. Контуры простейших ровные, окраска равномерная, протоплазма мелкозернистая. При окраске по Романовскому-Гимза хорошо видны жгутики и аксостиль. Под воздействием мутагена в образцах увеличивалось количество фиксированных к эпителиальным клеткам трихомонад различной величины, формы, отличающихся тинкториальными свойствами. Трихомонады прикреплялись к поверхности клеток шипиками, головной конец простейшего со жгутиками - наружу. Признаками старения и потери простейшими жизнеспособности являлось изменение тинкториальный свойств - усиление восприимчивости трихомонад к красителям (более темная окраска), интенсивное прокрашивание жгутиков и аксостиля. Под влиянием мутагена возникали безжгутиковые формы простейших (см. рисунок, д). Нередко жгутики (единичные или в пучках) удавалось обнаружить вблизи от таких форм трихомонад (см. рисунок, е). Неожиданным свойством мутированных трихомонад явилось увеличение продолжительности их жизни на 5-7 дней по сравнению с контрольным образцом. Гибель простейших в культуре наблюдалась через 5-7 дней, после воздействия мутагеном - через 8-12 дней. Обсуждение Нитрозогуанидин - химическое вещество, мощный мутаген, воздействующий на геном микроорганизмов и простейших. Проведенное исследование показало, что под влиянием мутагена увеличивалась жизнеспособность трихомонад, усиливался полиморфизм простейших и появлялись безжгутиковые формы. По мнению ряда авторов [2, 15, 20], причиной появления безжгутиковых и округлых форм является изменение условий внешней среды. Следовательно, безжгутиковые формы - одна из стадий развития простейшего, форма приспособления к изменению условий окружающей среды. Важно отметить, что появление в культуре безжгути- ковых форм простейших наблюдалось только при воздействии сильным раздражителем (мутагеном), вызывающим изменения на уровне генома. Слабый раздражитель - низкоинтенсивный лазер, действующий на уровне ковалентных связей, не оказывал подобного действия [25]. Проявлением действия мутагена является изменение ядер и опорного аппарата простейшего. Круглые формы T. vaginalis рассматриваются как этап самосохранения, выявляются после лечения и способствуют рецидивам заболевания [22]. Прикрепляясь к клетке хозяина T. vaginalis приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки. Для данной морфологической формы T. vaginalis характерна выраженная цитотоксичность по отношению к клеткам хозяина. Изменение фенотипа T. vaginalis зависит от фазы роста и физико-химических факторов среды и сопровождается коррелятивной изменчивостью внутреннего строения, характеризуя ее высокие адаптационные возможности [11, 23, 24]. Многоядерные трихомонады с множественными жгутиками на поверхности мембраны представляют собой не что иное, как колонию простейших, образованную в результате изменения характера размножения по типу шизогонии или палинтомии [15, 20]. Процесс последовательных делений без стадии роста напоминает дробление яйца многоклеточных животных. С нашей точки зрения, колонии простейших с характерной ориентаций жгутиками наружу и прикреплением шипиками к поверхности крупной или гигантской трихомонады, эпителиальной клетки или мицелию, следует рассматривать как проявление адаптации простейшего к неблагоприятным условиям внешней среды, а усиление питания - как необходимую меру для обеспечения его жизнедеятельности. Выявленные морфотипы влагалищных трихомонад могут быть связаны с особенностями адаптации простейших к изменению условий окружающей среды или с размножением. По мнению Н.М. Овчинникова [15] различные типы деления наблюдаются не как закономерная последовательность в жизненном цикле простейшего, а представляют собой различные реакции приспособления к изменяющимся условиям среды. Поэтому круглые, овальные, многоядерные, безъядерные формы вряд ли можно назвать атипичными, скорее всего, это лишь разные стадии развития паразита. Самый распространенный способ деления простейших - бесполый (размножение делением надвое). Плоскость деления всегда совпадает с продольной осью тела. Сначала делится митотическое ядро, затем, начиная с переднего конца, все тело простейшего, в том числе и жгутики. При этом старый жгутик иногда отходит к одной из дочерних особей, а у второй образуется из кинетосомы. В других случаях жгутик отбрасывается и в обеих дочерних особях образуется вновь [20]. Выявление мутированных длительно живущих форм трихомонад (продолжительность жизни увеличивалась на 5-7 дней по сравнению с контролем) является важным результатом эксперимента. Не исключено, что внутренние и внешние факторы среды обитания могут оказывать мутирующее действие и вызывать у простейшего изменение на уровне генома, тем самым, способствуя появлению длительно живущих и резистентных к метронидазолу форм трихомонад, обладающих выраженными адаптивными способностями, обеспечивающими их выживание в экстремальных условиях. Не исключено, что случаи вялотекущего и трудно поддающегося лечению МТ, обусловлены наличием именно амастиготных (безжгутиковых) форм простейших с измененным геномом, обладающих повышенным потенциалом к выживаемости. Результаты проведенного исследования открывают новые возможности в изучении причин устойчивости влагалищных трихомонад к метронидазолу, намечают новые пути проведения исследований, направленных на выявление факторов, способных в условиях in vivo вызывать мутации у простейших и повышать их устойчивость к медикаментозным средствам. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Наталия Иосифовна Сюч

ФКУ «Центральный военный клинический госпиталь им. П.В. Мандрыка» Минобороны России

Email: nsyuch@gmail.com
доктор мед. наук, профессор, зав. лабораторным отделением 107014, г. Москва, Россия

К. Э Мачкалян

ФКУ «Центральный военный клинический госпиталь им. П.В. Мандрыка» Минобороны России

107014, г. Москва, Россия

Н. В Махнева

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского» Минздрава Московской области

129110, г. Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы