Expression proteaseinhibitors receptor PAR-2 on neutrophils peripheral blood of patients with atopic dermatitis and their relation with heat shock proteins HSP90

Full Text

Протеазоактивированные рецепторы (PAR) играют многофункциональную роль в патогенезе атопического дерматита (АД) [1]. В настоящее время открыты четыре рецептора PAR (PAR-1, -2, -3, -4), которые присутствуют на многих типах клеток, включая клетки кожи и периферической нервной системы. Рецепторы PAR-2 принимают непосредственное участие в механизме развития зуда при АД [2, 3]. У человека рецептор PAR-2 (М 44 кД) состоит из 397 аминокислотных остатков (а.к.о.), включает экстраклеточ- ный N-концевой домен (75 а.к.о.), трансмембранный домен (155 а.к.о.), семь ленточных последовательностей, соединенных тремя экстраклеточными и тремя внутриклеточными петлями (по 117 а.к.о.) с малой петлей цитозольного С-концевого домена (50 а.к.о.). При протеолитическом расщеплении N-концевого домена протеазами образуется так называемый «привязанный» лиганд (tethered ligand), который вновь прикрепляется к консервативному региону и, таким образом, активирует рецептор PAR-2 [4]. Рецепторы PAR сопряжены с G-протеинами, могут быть активированы протеазами различных каталитических классов: трипсинами, тканевыми калликреинами (KLK2, KLK4, KLK5, KLK6, KLK14), факторами свертывания крови (FVIIa, FXa), металлопротеазами, трансмембранной протеазой эпителиазином и бактериальными протеазами, а также синтетическими пептидами (H-Ser- Leu-Ile-Gly-Lys-Val-NH2) [5]. В сыворотке крови больных АД в 4 раза повышена концентрация триптазы - эндогенного агониста рецептора PAR-2. Природным активатором рецептора PAR-2 является матриптаза тучных клеток, поэтому роль тучных клеток в молекулярных нарушениях и в развитии зуда при АД является фундаментальной. Эла- стаза нейтрофилов активирует PAR-2 рецептор, что стимулирует продукцию интерлейкина (IL)-13 макрофагами и Th2-лимфоцитами [6]. Активация PAR-2 сопряжена с IgE-индуцированным ответом на аллергены клеща домашней пыли в модельной системе АД у мышей [7]. Повышенная протеолитическая активность за счет протеаз микроорганизмов, а также нарушения функции природных внутриклеточных ингибиторов протеаз, способствуют постоянной активации PAR-2 и сопряженных сигнальных путей цитокинов, что поддерживает воспалительный процесс в коже и интенсивность зуда [8, 9]. Рецепторы PAR экспрессируются на мембране клеток практически всех органов и систем, регулируют многочисленные физиологические функции, в том числе, сокращение гладкомышечных клеток, чувствительность к боли, высвобождение липидных медиаторов, цитокинов, нейропептидов. Активация PAR связана с клиническими проявлениями в виде воспаления, вазодилятации, отека, боли [10, 11]. У больных АД повышена экспрессия рецепторов PAR-2 на первичных афферентных нервных волокнах. На пепти- дэргических нейронах TRP каналы функционально связаны с PAR-2, в частности, экспрессия PAR-2 коррелирует с экспрессией TRPA1 (transent receptor potential ankyrin 1) [12]. Экспрессия PAR-2 повышена на кератиноцитах, эндотелиальных и гладкомышечных клетках, а также в клетках иммунной системы. При активации PAR-2 повышается высвобождение IL-6 и гранулоцитарно-макрофа- гального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) из кератиноцитов у больных АД [13, 14]. Гранулоциты - первые клетки, которые мигрируют в очаг воспаления. Помимо фагоцитарных функций, синтеза антимикробных пептидов, нейтрофилы генерируют метаболиты кислорода и протеолитические ферменты. Показано присутствие рецепторов PAR-2 на нейтрофилах. Рецепторы PAR-2 стимулируют секрецию лактоферина и IL-8 нейтрофилами, модулирует экспрессию молекул адгезии, стимулирует миграцию нейтрофилов. Показано, что циркулирующие ней- трофилы экспрессируют исключительно PAR-2 и PAR-3, в покоящихся нейтрофилах полностью отсутствуют PAR-1 и PAR-4, при этом функционально активными являются только рецепторы PAR-2, весь пул предшественников которых локализуется во внутриклеточных гранулах, на поверхности клеток экспрессия PAR не регистрируется без специальной активации. Активация рецепторов Fcg обусловливает мобилизацию гранул к поверхности клетки и повышению экспрессии PAR-2 на мембране, причем независимо от транскрипции или синтеза белка. При стимуляции бактериями экспрессия PAR-2 на поверхности нейтрофилов повышается через 5 мин и достигает пика через 60 мин [15]. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли PAR-2 рецепторов в патогенезе АД, отсутствуют публикации, касающиеся экспрессии рецепторов PAR-2 на нейтрофилах при АД. Только в одной обзорной работе [3] косвенно затронута эта тема. Учитывая патогенетическую значимость таких исследований, была поставлена цель определить уровень экспрессии рецепторов PAR-2 на нейтрофилах в зависимости от тяжести течения заболевания. Поскольку очевидно наличие связи между стрессом и уровнем экспрессии рецепторов PAR-2, также параллельно определяли экспрессию белков теплового шока HSP90 и рецептора PAR-2 на клетках крови больных АД в начальный период обострения. Материал и методы Обследованы 164 мужчин, больных АД в возрасте от 18 до 38 лет. Все пациенты подписывали форму информированного согласия для участия в исследовании. Критериями исключения пациентов из исследования: наличие острых вирусных или бактериальных инфекций; онкологические, соматические заболевания; системные аллергические или воспалительные заболевания, беременность, психомоторные расстройтсва. Тяжесть течения АД оценивали по индексу SCORAD (менее 30 баллов - легкое течение, от 30 до 60 баллов - среднетяжелое, более 60 баллов - тяжелое). У каждого больного собирали аллергоанамнез, при необходимости ставили кожные пробы на аллергены. Всем пациентам проводили лабораторные исследования, включающие общий анализ крови и мочи, определение уровня общего и специфического IgE, а также иммунный статус. Здоровые доноры (21 мужчина) в возрасте от 18 до 38 лет не курили, не принимали лекарственные препараты, не имели в анамнезе аллергических и хронических воспалительных заболеваний, не переносили острых воспалительных заболеваний в последние 2 мес и не употребляли алкоголь в течение 2 сут до обследования. Собирался семейный анамнез доноров для исключения наличия аллергических заболеваний у родственников. При осмотре кожный покров у всех доноров был свободен от высыпаний. Доноры подписывали информированное согласие, идентичное информированному согласию пациентов. Работу с кровью людей проводили согласно международным правилам работы с биологическим материалом. Кровь брали натощак из локтевой вены в вакутейнер с ЭДТА. Исследование клеток периферической крови проводили на гематологическом анализаторе LH 700 (“Beckman Coulter Inc.”, США), данные предоставлялись как число популяций клеток в 1 мл крови. Для получения лейкоцитарной взвеси кровь переносили в центрифужные пробирки и добавляли по 15 мл лизирующей жидкости (коммерческий препарат фирмы “Becton Dickinson” для удаления эритроцитов). Инкубировали 5 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 200g. Супернатант удаляли, осадок встряхивали, добавляли 199 среду и отмывали суспензию клеток центрифугированием. Для получения мононуклеаров крови осадок разводили фосфатным буфером (PBS, “Sigma”) 1:1 и по 2 мл наслаивали на градиент плотности фиколла-верографина 1,078 г/л. Градиенты центрифугировали 20 мин при 2000 g. Моно- нуклеары отбирали из интерфазы, отмывали средой 199. Чистую популяцию нейтрофилов периферической крови выделяли на градиенте плотности Перколла (Percoll, “Sigma- Aldrich”, США). Для приготовления градиента в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл последовательно наслаивали по 3 мл: изотонического раствора Перколла (90%), затем растворы с плотностью 81%, 70%, 60% и 55%. На готовые градиенты наслаивали 5 мл крови с ЭДТА, полученной в день исследования утром натощак, разведенную 1:1 стерильным физиологическим раствором. Градиенты центрифугировали 20 мин при температуре 22 °C при ускорении 500g. После центрифугирования на дне пробирки концентрировались эритроциты, нейтрофилы выделялись в интерфазе между слоями Перколла плотностью 81% и 70%; лимфоциты - между 70% и 60% Перколла, на поверхности первого слоя градиента выделялись тромбоциты. Каждую популяцию клеток отбирали пастеркой, переносили в центрифужные пробирки с однократным PBS, отмывали дважды центрифугированием 10 мин при температуре 22 °C и ускорении 200g. Выход нейтрофилов из 1 мл крови составлял 1,5-5,2 х 106 клеток. Контроль выделения клеток проводили морфологически по окраске гематоксилином и эозином (анализом в световом микроскопе), а также методом проточной цитометрии. Клетки отмывали в PBS, доводили до концентрации 0,5 х 106 клеток в 50 мкл PBS, добавляли 2 мкл антител. Для окраски на рецепторы PAR-2 использованы антитела N19 (sc-8206, козьи поликлональные, “Sant Cruz Biotechnology”, США), к ним вторичные антитела анти-козьи, меченные флю- оресцеинизотиоцианатом (FITC). Мышиные моноклональные антитела H90-10 (ab58950, “Abcam”) к белкам теплового шока HSP90, к ним вторичные антитела анти-мышиные, меченные фикоэритрином (РЕ) (“Abcam”). Клетки инкубировали 50 мин при температуре 4 °C, затем отмывали центрифугированием при 400g, осаждали, добавляли 50 мкл холодного 3% BSA на PBS и 10 мкл вторичных антител. Клетки тщательно перемешивали и инкубировали 40 мин при температуре 4 °C, затем отмывали центрифугированием при 400g, осадок встряхивали и фиксировали 2% параформальдегидом на PBS [www.abcam.com/protocols]. Клетки отмывали в PBS, добавляли 100 мкл 1% параформальдегида на PBS, оставляли на 10 мин, затем добавляли 100 мкл 0,1% сапонина на PBS, инкубировали еще 15 мин при комнатной температуре. Клетки трижды отмывали в PBS, доводили до концентрации 0,5 х 106 клеток в 50 мкл, добавляли 2 мкл соответствующих mAb, и инкубировали в течение 50 мин при температуре 4 °C. Далее клетки отмывали и докрашивали вторичными антителами. Суспензию клеток в объеме 100 мкл 1% параформальдегида на PBS хранили в темноте при температуре 4 °C. Флюоресценцию клеток анализировали на проточном цитометре FACSCalibur по программе SimulSet. Флюоресценцию FITC измеряли на канале FLl-А при длине волны 530 ± 5 нм. Флюоресценцию РЕ измеряли на канале FL2^ при длине волны Рис. 1. Примеры гистограмм, соответствующих флюоресценции рецептора PAR-2 на нейтрофилах периферической крови больных атопическим дерматитом. а - гистограмма экспрессии рецепторов PAR-2 на плазматической мембране нейтрофилов больных атопическим дерматитом с легким течением; б - гистограмма экспрессии рецепторов PAR-2 на плазматической мембране нейтрофилов больных атопическим дерматитом средней тяжести; в - пример экспрессии рецепторов PAR-2 на мембране нейтро- филов больного с тяжелым течением атопического дерматита. 605 ± 5 нм. Интенсивность флюоресценции приводили к внутреннему стандарту. В качестве контроля измеряли флюоресценцию изотипспецифичных F(ab’)2 фрагментов иммуноглобулинов. В каждом образце анализировали 10 тыс. событий на гейт каждой из популяций клеток (лимфоцитов, моноцитов, нейтро- филов). Данные анализировали по программе ANOVA и представлены как М ± m. Сравнение между двумя группами проводили по t-критерию Стьюдента, статистический анализ нескольких групп проводили с помощью непараметрического анализа методом множественного сравнения по критерию Ньюмена-Кейлса, p < 0,05 считали как статистически значимое различие между группами. Результаты Согласно данным литературы [12] у молодых здоровых людей рецепторы PAR-2 на нейтрофилах локализуются не на поверхности клеток, а находятся в гранулах и появляются на поверхности только в результате активации клеток. Мы считали отсутствие экспрессии PAR-2 на плазматической мембране клеток как вариант нормы. Для подтверждения этой установки была определена экспрессия рецепторов PAR-2 на поверхности нейтрофилов здоровых доноров. Однако у 2 юношей 18 лет экспрессия PAR-2 на нейтрофилах была положительной (на 32% и 36% клеток соответственно при интенсивности флюоресценции 28 и 31 усл.ед.) [12]. При бактериологическом анализе смывов кожного покрова у этих лиц обнаружена контаминация золотистым стафилококком. Эти лица были исключены из исследования: дальнейшую работу проводили с 34 донорами. Таблица 1 Экспрессия рецепторов PAR-2 на плазматической мембране нейтрофилов при атопическом дерматите в зависимости от тяжести течения Классификация по индексу SCORAD Показатель легкое средней тяжелое течение течение менее 20 (n = 55) тяжести 20-40 (n = 81) 40-60 (n = 22) более 60 (n = 6) PAR-2+-клеток, % 51 ± 12 71 ± 5 78 ± 4 82 ± 1 Интенсивность флюоресценции PAR-2, усл.ед. 29 ± 5 44 ± 7 121 ± 8 139 ± 12 На первом этапе работы определяли экспрессию рецепторов на поверхности непермеабилизованных клеток. У всех больных АД на плазматической мембране клеток крови присутствовали рецепторы PAR-2. Пример данных проточной цитометрии по интенсивности флюоресценции клеток, окрашенных антителами к PAR-2, приведен на рис. 1. По мере усиления тяжести течения повышается число клеток, экспрессирующих рецепторы PAR-2 на мембране, а также плотность этих рецепторов, на что указывает повышение интенсивности флуоресценции. При анализе данных, полученных в обследованной группе больных, было установлено, что уровень экспрессии рецепторов PAR-2 на плазматической мембране нейтрофилов определяется степенью тяжести заболевания (табл. 1). Статистически значимое различие получено между группами больных с легким и более тяжелым течением, как по проценту нейтрофилов, экспрессирующих PAR-2 на поверхности плазматической мембраны, так и по интенсивности флюоресценции PAR-2 (p < 0,05). Между группами больных с легким и тяжелым течением АД достоверное различие было более значимо (p < 0,001). Следующим этапом анализа было определение экспрессии рецепторов PAR-2 в зависимости от площади поражения тела (табл. 2). Получено статистически значимое различие по проценту PAR-2-положительных нейтрофилов только для группы с минимальной площадью поражения и распространённым или диффузным поражением кожи (p < 0,05). По интенсивности флуоресценции (относительной плотности рецепторов PAR-2 на клетке), статистически значимые различия получены между группами с ограниченным и распространенным поражением (p < 0,05). Среди больных АД с нормальными значениями IgE в сыворотке крови колебания уровня экспрессии рецепторов PAR-2 были значительными (от 18 до 64%, в среднем 45 ± 14%). Разброс данных при высоким уровне IgE в сыворотке крови был также выраженным (от 52 до 85%, в среднем 71 ± 11%), но показатели экспрессии PAR-2 для IgE-положительных больных статистически достоверно выше (p < 0,05). Таблица 2 Экспрессия рецепторов PAR-2 на поверхности нейтрофилов периферической крови у больных атопическим дерматитом в зависимости от площади поражения Классификация типов распространенности процесса (по согласительному протоколу 2002 г.) Показатель ограниченно локализованный, площадь поражения менее 1% (n = 18) ограниченно локализованный (n = 41) распространенный (n = 77) диффузный (n = 28) PAR-2+-клеток, % 31 ± 7 59 ± 7 77 ± 8 78 ± 1% Интенсивность флюоресценции PAR-2, усл.ед. 23 ± 5 58 ± 7 115 ± 9 126 ± 12 усл.ед. Для установления внутриклеточного уровня рецепторов PAR-2 проведена окраска фиксированных и пер- меабилизованных клеток антителами N19 к рецепторам PAR-2. На рис. 2 приведены примеры интенсивности внутриклеточной флюоресценции при окраске антителами к рецепторам PAR-2. Установлено повышение экспрессии внутриклеточного PAR-2 при увеличении тяжести течения заболевания и распространенности процесса. При измерении интенсивности внутриклеточной флюоресценции рецепторов PAR-2, экспрессированных на нейтрофилах, было установлено, что при легкой степени тяжести АД (менее 20 по индексу SCORAD) (n = 55) mean флюоресценции (т.е. интенсивность флюоресценции), составляла 135 ± 4 условные единицы (усл.ед.), что несколько повышено по сравнению с показателями доноров (126 ± 4 усл.ед.), но статистически недостоверно. При АД средней тяжести (20-40 по SCORAD) (n = 81) mean флюоресценции 148 ± 7 усл.ед. (p < 0,05 по сравнению с донорами). При тяжелом течении АД (40-60 по SCORAD) (n = 22) mean фл.оресценции рецепторов PAR-2 была 165 ± 6 усл.ед. (p < 0,05 по сравнению с донорами, а также по сравнению с группой больных легкой степенью АД). У 6 больных с индексом SCORAD более 60 mean флюоресценции рецепторов PAR-2 составляла 172 ± 9 усл.ед., что также достоверно выше, чем у доноров и больных АД легкой степенью (p < 0,05). При анализе интенсивности флюоресценции рецепторов PAR-2 с зависимости от площади поражения кожи при ограничено-локализованной распространенности процесса, когда площадь поражения кожи не превышала 1% (площадь ладони) (n = 18) mean флюоресценции составляла 137 ± 6 усл.ед., что не являлось статистически достоверным отличием от показателей доноров. При ограниченно-локализованном АД (n = 41) mean флюоресценции была 144 ± 7 усл.ед. (p < 0,05 по сравнению с донорами), При распространенном процессе (n = 77) mean флюоресценции 161 ± 9 усл.ед. (p < 0,05 по сравнению с донорами), при диффузном поражении кожи (n = 28) mean флюоресценции составляла 169 ± 12 усл.ед. (p < 0,05 по сравнению с донорами и больными с ограниченно-локализованным АД). Из группы с локализованным типом поражения (не более 1% площади тела) была выделена группа пациентов (n = 18) с давностью обострения заболевания не более одной недели (!). В этой группе одновременно с исследованием экспрессии рецепторов PAR-2 была определена экспрессия белков теплового шока HSP90 с целью определения возможной роли HSP90 в индукции рецепторов PAR-2 на нейтрофилах. Идея этого исследования заключалась в том, что белки теплового шока HSP90 могут регулировать экспрессию PAR-2 за счет перекрестного связывания рецептора CD16, который необходим для активации PAR-2 бактериальными протеазами. Рецепторы для Fc-фрагментов IgG (FcyR) I- III: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), присутствуют на клетках крови. HSP90 - компонент многомерного рецепторного комплекса на плазматической мембране нейтрофилов, включающего рецепторы хемокинов, инте- Рис. 2. Примеры интенсивности флюоресценции фиксированных и пермеабилизованных нейтрофилов периферической крови, окрашенных антителами N19 к рецепторам PAR-2. а - флюоресценция внутриклеточных рецепторов PAR-2 в нейтрофилах больных атопическим дерматитом с легким течением; б - флюоресценция внутриклеточных рецепторов PAR-2 в нейтрофилах больных атопическим дерматитом средней тяжести. гринов, TLR, CD11b и CD16. Одна из функций HSP90 - перемещение и экстернализация рецептора CD16 [16]. Для данной выборки лиц с минимальными клиническими проявлениями АД нам удалось установить определенную закономерность в повышении экспрессии рецепторов PAR-2 на нейтрофилах одновременно с повышением экспрессии белков теплового шока HSP90. При минимальном значении экспрессии рецепторов PAR-2 на плазматической мембране часть клеток содержала крайне низкое количество белка HSP90 (рис. 3, а). По мере усиления тяжести течения у больных АД установлено одновременное повышение экспрессии рецепторов PAR-2 и белков теплового шока HSP90 (рис. 3, б). Можно сделать вывод об определенном влиянии индуцированного под влиянием стресса белка теплового шока HSP90 на повышение экспрессии рецепторов PAR-2 на нейтрофилах. Обсуждение Проведен анализ экспрессии рецепторов PAR-2 (как поверхностных, так и внутриклеточных) на нейтрофилах периферической крови больных АД. Показано, что по мере усиления тяжести течения заболевания и увеличения площади поражения одновременно повышается процент клеток, экспрессирующих PAR-2 на плазматической мембране. Учитывая многогранную роль рецепторов PAR-2 в регуляции воспалительного процесса можно говорить о функциональном значении повышения экспрессии рецепторов PAR-2 на нейтрофилах в патогенезе АД. Наиболее значимые результаты работы касаются двойной окраски клеток на рецепторы PAR-2 и белки теплового шока HSP90. Белки теплового шока HSP90 регулируют стабильность, активность, внутриклеточный сортинг клиентских белков, вовлеченных в многочисленные внутриклеточные процессы. Мы впервые обнаружили, что в начальном периоде обострения АД повышается уровень экспрессии HSP90 и это повышение происходит одновременно с увеличением флюоресценции рецепторов RAP-2. Для HSP90 известно, что они работают и как транспортеры рецепторов, перемещая их из цитозоля или эндо- сомальных компартментов к плазматической мембране. Полученные нами данные указывают на определенную роль HSP90 в повышении экспрессии PAR-2, что показано впервые и имеет фундаментальное значение. Для изучения молекулярных механизмов этого явления мы планируем продолжение экспериментов и проведение дополнительных исследований. Рис. 3. Примеры интенсивности флюоресценции фиксированных и пермеабилизованных нейтрофилов периферической крови, одновременно окрашенных антителами N19 к рецепторам PAR-2 (FITC) и HSP90 (РЕ). а - флюоресценция внутриклеточных рецепторов PAR-2 (окрашенных FITC) и белков теплового шока HSP90 (окрашенных фикоэритрином - РЕ) в нейтрофилах больных атопическим дерматитом; б - флюоресценция внутриклеточных рецепторов PAR-2 (окрашенных FITC) и белков теплового шока HSP90 (окрашенных РЕ) в нейтрофилах больных атопическим дерматитом средней тяжести. Известно, что в норме PAR-2 не находятся на поверхности нейтрофилов, и только после связывания Fcg-RIII (CD16) рецепторов бактериальными лигандами они перемещаются из цитозоля на плазматическую мембрану. Учитывая роль HSP90 не только как молекулярного шапе- рона, но и как транспортера некоторых рецепторов, вполне вероятно предположить, что стресс вызывает также повышение экспрессии PAR-2 на плазматической мембране клеток. Повышение экспрессии PAR-2 способствует развитию клинических проявлений АД. Выводы 1. На плазматической мембране нейтрофилов больных АД повышена экспрессия рецепторов PAR-2 по сравнению со здоровыми донорами. 2. По мере усиления тяжести течения АД, увеличения площади поражения экспрессия рецепторов PAR-2 на плазматической мембране нейтрофилов также повышается. 3. В начале обострения процесса при минимальной площади поражении кожи на нейтрофилах периферической крови обнаружено одновременное повышение экспрессии рецепторов PAR-2 и белков теплового шока HSP90. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

I. V Elistratova

Main Military Clinical Hospital of Internal Troops of the Ministry of Internal Affairs of Russia

143915, Balashiha, Russia

Sergey G. Morozov

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: biopharm@list.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Corresponding Member of Russian Academy of Sciences, deputy director for scientific work 125315, Moscow, Russia

I. A Zakharova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

125315, Moscow, Russia

References

Supplementary files