Sequencing methods in dermatology

Full Text

Метод полногеномного секвенирования открыл большие возможности для ученых, занимающихся фундаментальными аспектами медицины. Полногеномное секвенирование (whole genome sequencing) позволяет получать информацию о всей ДНК, находящейся в клетках человека [1]. Первым из предложенных методов секвенирования стал способ автоматизированного секвенирования по Сенгеру [2], применявшийся на протяжении нескольких десятков лет и с помощью которого был реализован проект геном человека [3]. Но данный подход в секвенировании имел ряд недостатков, поскольку был непригоден для быстрого рутинного исследования геномов человека в клинической практике. Сегодня для реализации задач полногеномного секвенирования предложены «методы нового поколения» секвенирования (Next-Generation Sequencing, NGS), в основу которых положены разнообразные подходы с применением специальных комбинаций приготовления ДНК-матриц, секвенирования, визуализации и, в конеч- Основные задачи методики секвенирования генов. ном итоге, составления непосредственно последовательностей ДНК «сиквенсов» [4]. Применение данного метода достаточно многогранно и может быть использовано для решения следующих задач (см. рисунок): - Поиск мутаций, ассоциированных с различными заболеваниями, а также генов, ассоциированных с различными фенотипическими признаками. Например, определение типа заболевания у больного буллезным эпи- дермолизом. - Проведение обследования пациентов из группы риска с целью выявления возможных генетических дефектов у потомства, а также пренатальная диагностика плода, когда секвенированию подвергается ДНК будущего ребенка. Данный метод актуален в семьях, имеющих детей с разными генодерматозами. - Картирование генов, представляющее собой поиск места расположения в геноме гена либо генетического маркера, а также определение расстояния между ними [5]. Так, ученым удалось определить с помощью картирования гена LIPH в локусе 3q27 генетически обусловленную природу гипотрихоза 1-го типа [6]. - Поиск новых генов и их изоформ [7]. Применение NGS-секвенирования в дерматоонкологии Использование методов автоматизированного секве- нирования по Сенгеру и секвенирования нового поколения (NGS) нашло широкое применение в онкологии, в частности в дерматоонкологии, для определения спектра мутаций у больных меланомой кожи. Проведение анализа генома из образцов меланомы является довольно трудной задачей, что связано с большим количеством мутаций - «пассажиров», которые возникают под влиянием мутагенного воздействия ультрафиолетового облучения (УФО), нестабильности генома или просто большого количества делений клеток. Данные мутации являются отражением мутационного фенотипа опухоли, но могут не иметь важного значения в патогенезе новообразования [8]. Известно, что меланома является опухолью с одним из наиболее высоких уровней мутаций, превалирующее число которых обусловлено эффектами УФО в коже, например, транзиции цитозина на тимин (C>T) [9]. Секвенирование нового поколения является важным инструментом для изучения геномики меланомы и выявления прогностических биомаркеров, в том числе с использованием формалинфиксированной первичной опухоли, заключенной в парафин. Драйверные мутации присутствуют в опухолевых клетках организма и отсутствуют в других (неопухолевых) клетках. Данный вид мутаций является триггером (т.е. главным пусковым фактором) в опухолевой трансформации нормальных клеток и образовании первичного опухолевого клона. Драйверные мутации создают генетическую нестабильность и приводят к появлению вторичных мутаций, под влиянием которых могут появляться уже новые субклоны опухолевых клеток, которые будут устойчивы к химиотерапии. Таким образом, драй- верная мутация создает идеальную мишень для таргет- ных («целевых») препаратов, поскольку установлено, что жизнеспособность опухолевой клетки зависит от наличия драйверных мутаций, которые «блокируют» другие механизмы биологической регуляции в клетках. При меланоме обнаруживают пять драйверных мутаций. Мутации в гене BRAF затрагивают, как правило, 15-й экзон, при этом 80% всех мутаций в данном гене приходится на 600-й кодон. В 90% случаев здесь происходит замена глютаминовой кислоты на валин BRAFV600E: нуклеотид в 1799-м положении заменяется с тимина на аденин (GTG>GAG) [10]. Второй по частоте является мутация BRAFV600K, представляющая собой замену лизина на валин (GTG>AAG) и встречающаяся в 5-6% случаев. Более редкими разновидностями мутаций в данном гене является BRAFV600R (GTG>AGG), где происходит замена глютаминовой кислоты на лизин, и BRAFV600D (GTG>GAT) с заменой глютаминовой на аспарагиновую кислоту. В двух последних видах мутаций происходит замена уже не одного, а двух нуклеотидов в кодоне [11]. NRAS кодирует белок семейства RAS, участвуя в передаче пролиферативных сигналов от тирозинкиназ- ных рецепторов ядру. NRAS имеет «встроенную» ГТФ- активность (проявляющую гидролитическую активность в отношении гуанозинтрифосфата), которая осуществляет негативную ауторегуляцию гена. В случае образования комплекса с ГТФ NRAS способен передавать сигналы следующему участнику каскада - белку BRAF [12]. Мутации в гене NRAS наиболее часто встречаются в кодонах 12, 13 и 61 [13]. Онкоген KIT - мембранный тирозинкиназный рецептор, принимающий участие в дифференцировке клеток меланоцитарного ряда [14]. Ген c-KIT играет важную роль в патогенезе меланом участков кожи, подверженных хронической инсоляции, акральной меланомы, а также меланомы слизистых оболочек. Наиболее распространенными мутациями в данном гене являются мутации KITL576P в 11-м экзоне, а также мутация KITK642E в 13-м экзоне. Кроме того, у отдельных пациентов описаны случаи возникновения мутаций в данном гене в других участках генома [15] (табл. 1). Мутация в гене GNAQ определяется в 5-м экзоне и встречается у 2% больных меланомой [16]. При этом меланомы, не содержащие ни одной из перечисленных мутаций, принято считать паннегативными [17]. Благодаря NGS-секвенированию было обнаружено, что и в паннегативных меланомах обнаруживаются редкие мутации, в том числе мутации в гене GNAO1 [16]. Также было выявлено 12 генов, мутации в которых выявляются в паннегативных меланомах: AlK, STK31, DGKI, RAC1, EPHA4, ADAMTS18, EPHA7, ERBB4, TAF1L, NF1, SYK, KDR. включая 5 генов RAC1, ADAMTS18, EPHA7, TAF1L [17]. Открытие драйверных мутаций при меланоме кожи привели к активизации во всем мире попыток целенаправленного воздействия на данную мутацию. Наиболее распространенной мутацией у больных меланомой была мутация BRAF, она и стала первой мишенью для воздействия [18]. Первым неселективным ингибитором BRAF был сорафениб, изначально он был разработан как C-RAF- Таблица 1 Основные мутантные гены характерные для меланомы кожи [15] Ген Сигнальный путь Вид абберации В каких типах опухолей обнаруживают Число больных Наличие таргетной терапии BRAF MAPK Точечные мутации/слияние генов (Gene fusion) NRASнегативные опухоли У 50-60% BRAF-ингибиторы + MEK- ингибиторы; BRAF-ингибиторы + EGFR-ингибиторы+ AKT- ингибиторы NRAS MAPK, PI3K, RALGDS Точечные мутации, амплификации BRAFнегативные опухоли У 20-25% MEK-ингибиторы + CDK- ингибиторы KIT MAPK, PI3K Точечные мутации, амплификации BRAF- и NRAS- негативные опухоли 1% от всех меланом; 10% меланомы слизистых оболочек; 10% меланомы акральной локализации Сунитиниб, нилотиниб, иматиниб GNAQ/GNA11 Ген GNAQ и его гомолог GNA11 кодируют а-субъединицу гете- ротримерного G-белка с активностью ГТФазы, активируют MAPK-митогенный путь Точечные мутации BRAF и NRAS- негативные меланомы 1% от всех меланом и 40-50% из увеальных меланом MEK-ингибиторы + PI3K- ингибиторы, энзастаурин Примечание. Gene fusion - процесс слияния двух смежных генов в один при транскрипции, через делению или мутацию трансляционного стоп-кодона, при котором используется сигнал терминации транскрипции в расположенном гене; EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) - рецепторы эпидермального фактора роста; AKT (AC-alpha serine/threonine-protein kinase) (серинтреони- новой протеинкиназы), имеются данные литературы о том, что данный путь активируется по мере увеличения стадии заболевания. Таблица частично заимствована [15]. Формы буллезных дерматозов в зависимости от генетического статуса и типа наследования заболевания Таблица 2 Тип эпидермолиза Основной подтип Тип наследования Гены, в которых произошла мутация Простой буллезный эпидермолиз Супрабазальный Базальный Аутосомно-доминантный, возможен аутосомно-рецессивный PKP11 (плакофиллин 1) DSP (десмоплакин) KRT5 (кератин 5) KRT14 (кератин 14) PLEC1 (плектин) ITGA6,1TGB4 Дистрофический буллезный эпидермолиз - Аутосомно-доминантный Аутосомно-рецессивный COL7A1 COL7A1 Пограничный буллезный эпидермолиз Тип Херлитц Другие типы Аутосомно-рецессивный LAMA3, LAMAB3, LAMC2 (ламинин 332) LAMA3, LAMAB3, LAMC2 (ламинин 332) COL17A1 (коллаген 17-го типа) ITGA6, ITGB4 Синдром Киндлера - Аутосомно-рецессивный KIND 1 (Киндлин 1) ингибитор. Сорафениб модулирует активность фактора роста сосудистого эндотелия и рецептора тромбоцитар- ного фактора роста. Результаты его применения были не очень успешными как в составе моно-, так и полихимиотерапии [19]. Потребовалось несколько лет, чтобы разработать селективный BRAF-ингибитор. Одним из первых селективных ВRAF-ингибиторов являлся PLX4032/ RG7204. Препарат показывал хорошие клинические результаты с регрессией опухоли у больных меланомой кожи [20]. Главной же проблемой BRAF-ингибиторов стало развитие резистентности к ним, в основе которой лежит реактивация сигнального каскада RAF-MEK и активация других механизмов передачи сигнала, которые, в свою очередь, также могут приводить к нерегулируемому увеличению пролиферации меланоцитов [21]. В последние годы был зарегистрирован новый таргетный препарат дабрафе- ниб для лечения больных меланомой, положительной по BRAFV600E [22]. В отличие от PLX4032/RG7204 (вему- рафениба), дабрафениб действует не только при мутации V600E, но и при мутации V600K в гене BRAF. Таким образом, при помощи секвенирования был изучен мутационный состав меланомы кожи и выделены основные мутации, которые встречаются при меланоме наиболее часто (табл. 2). Были сформулированы основные клинические характеристики данной группы больных. 1) Мутации в гене BRAF встречаются со следующей частотой в различных клинических группах: у 59% больных меланома располагается на участках кожи не подвергающихся хронической инсоляции; у 11% - на коже, подверженной постоянной инсоляции; у 11% - на слизистых оболочках; 23% таких больных имеют меланому акральной локализации [23]. 2) NRAS-мутации встречаются примерно в 20% случаев меланомы кожи с локализацией опухоли на участках кожи, подверженных регулярной инсоляции; у 10% больных - с меланомой акральной локализации, у 5-13% - с меланомой слизистых оболочек. Причем у больных меланомой слизистых оболочек наиболее часто данная мутация встречается в меланомах синоназальной локализации [24]. 3) c-KIT-мутация. Активация гена с-KlT за счет мутации наблюдается только в 2-6% случаев поверхностной меланомы кожи, но мутации и амплификацию с-KlT выявляют с частотой 23-36% при акральной меланоме, 15-39% - при меланоме слизистых оболочек, 28% - при меланоме открытых участков тела (связана с инсоляцией) [25]. Мутации в гене c-KlT при меланоме слизистых оболочек чаще встречаются при локализации в области гениталий и аноректальной области [26]. 4) GNAQ/GNA11 -мутация в 5-м экзоне данного гена встречается примерно у 2% больных меланомой кожи. Наиболее часто встречающаяся замена происходит в 209-й позиции и связана она с заменой глютаминовой кислоты на лейцин (CAA>CTA). Кроме того, описаны случаи возникновения меланомы из голубого невуса [15]. У таких пациентов наблюдается мутация, связанная с заменой аденина на тимин в 626-м кодоне. Учитывая данный факт, предполагают, что данный вид мутации ассоциирован с малигнизацией голубого невуса в меланому. Необходимо отметить, что мутации в генах BRAF и NRAS встречаются также и при доброкачественных меланоцитарных новообразованиях кожи. Они определяются в диспластических невусах, врожденных невусах, а также в невусах, обладающих высокой юнкциональ- ной активностью. Так, самым распространенным видом мутаций в невусах является мутация в гене BRAFV600E, встречающаяся в 82% от всех приобретенных в течение жизни невусов. Мутации в генах как BRAF, так и NRAS обнаруживают почти в 95% врожденных невусов [27]. При этом врожденные невусы имеют повышенный риск озлокачествления в меланому [28]. Высокая распространенность BRAF-мутации наблюдается и при диспластиче- ском невусе, который расценивают как меланомоопасный невус, он требует тщательного динамического контроля врача-дерматовенеролога. При этом данный вид невусов может сохраняться у пациентов годами, поэтому переход данного вида невуса в злокачественную меланому, скорее всего, возможен только при наличии дополнительных генетических нарушений. Большой процент мутаций BRAF и NRAS в невусах доказывает то, что активация МАРК-киназного сигнального каскада путем возникновения мутаций в генах BRAF и NRAS не является достаточной для злокачественной трансформации. BRAF-мутации способствуют злокачественной гиперплазии меланоцитов, но без дополнительных мутаций не способны инициировать процесс канцерогенеза. В частности, усиленная экспрессия онкогенных BRAF и NRAS в нормальных меланоцитах невуса запускает в них процессы апоптоза, тем самым подвергая клетки запрограммированной клеточной гибели, и параллельно с этим ограничивает процессы пролиферации в них. Говоря о дополнительных генетических трансформациях, необходимо сказать об усилении активации протеинки- назы AKT, что рассматривают как один из дополнительных факторов, способствующий малигнизации доброкачественного невуса. Это связано с тем, что активация данной протеинкиназы способна ингибировать апоптоз как в нормальных меланоцитах, так и в неизмененных фибробла- стах, имеющих мутацию BRAFV600E. Усиление активности AKT наблюдается в 17% доброкачественных невусов, в 43% диспластических невусов, в 49% случаев первичной меланомы, в 77% - метастатической меланомы [17]. Таким образом, выявление мутаций в генах BRAF и NRAS при врожденных и диспластических невусах, а также невусах, проявляющих интенсивную пролиферативную активность за короткий промежуток времени, может быть прогностически значимым, требующим дальнейшего анализа. В связи с постоянно совершенствующимися знаниями молекулярно-генетической структуры меланомы с помощью NGS-секвенирования усложняются и мультигенети- ческие панели для градации спектра мутаций. Следует также упомянуть о роли секвенирования при опухолях кожи немеланоцитарного генеза. Базальноклеточный рак кожи развивается преимущественно на открытых участках тела, поэтому частой его локализацией является кожа лица (щеки, уши, нос, веки) и шеи. Фактор инсоляции является особенно важным, что подтверждается рядом исследований, в частности у жителей США с более частым выявлением базально-клеточного рака кожи на левой половине лица, в отличие от жителей Великобритании, у которых страдает больше правая половина лица и шеи, что связывают с неравномерной инсоляцией и открыванием окна при вождении автомобиля [29]. Локализацию плоскоклеточного рака кожи также чаще определяют на участках кожи, хронически подвергающихся инсоляции. Риск развития плоскоклеточного рака кожи имеет отчетливую связь с растущими суммарными дозами солнечной экспозиции, независимо от ее типа. Доказано, что под влиянием инсоляции происходит формирование фотодимеров, представляющих собой обрыв цепи ДНК. Помимо этого, под воздействием УФО образуются мутации в гене p53. Мутации в данном гене происходят примерно в 50% случаев при плоскоклеточном раке кожи, при актиническом кератозе, который рассматривают в качестве предрака, а также при базально-клеточном раке кожи [30]. Ген p53 выполняет роль онкосупрессора, представляя собой функцию «сторожа» генетического аппарата клетки, определяя повреждения в клетках, а впоследствии способствует удалению поврежденных клеток, запуская процессы апоптоза. Измененный ген р53 не способен справляться с данными функциями, из-за чего в клетке происходит дисбаланс между процессами пролиферации и апоптоза и развивается опухоль. Немаловажным является иммунологический аспект в формировании плоскоклеточного рака кожи. Так, пациенты, находящиеся на длительной иммуносупрессивной терапии, больше подвержены данному виду рака, что связано со снижением эффективности работы системы иммунобиологического надзора. Кроме того, плоскоклеточный рак кожи ассоциирован с HPV-инфекцией кератиноцитов. Вирус папилломы человека (ВПЧ) 16, 18, 31, 33, 35 и 45го типов вызывает плоскоклеточный рак вульвы, полового члена, заднепроходного отдела и ногтевых валиков [31]. Методы секвенирования и заболевания кожи неопухолевого генеза С помощью NGS были обнаружены различные мутации, играющие важную роль в развитии некоторых гено- дерматозов [32]. В частности, были выявлены мутации в гене ABCC6 при эластической псевдоксантоме [33], гене стероидной сульфатазы (STS) при X-сцепленном ихтиозе, что приводит к нарушению кератинизации и появлению избыточного ороговения кожи [34]. С помощью секвенирования удалось выявить 66 ранее незарегистрированных штаммов Propionibacterium acnes, идентифицировать штаммы максимально вирулентные, а также преимущественно ассоциированные с развитием акне. Также с помощью метода секвенирования были изучены последовательности генома патогенных и непатогенных вариантов Propionibacterium acnes. Выявлено, что один из подтипов содержит нуклеотидную замену G1058C, которая обеспечивает полную резистентность к тетрациклину микроорганизма [35]. Кроме того, были выявлены определенные подтипы Propionibacterium acnes (RT4 и RT5), способные вызывать наиболее выраженную иммунологическую реакцию у пациента, что сопряжено с повышенным риском формирования рубцов на коже. В исследованиях последних лет большую роль уделяют применению метода секвенирования у больных буллезными дерматозами. Были выявлены нарушения в гене десмоглеин 3 (DSG3) у больных пузырчаткой [36]. DSG3 вырабатывается при всех видах пузырчатки во всех слоях эпидермиса, что имеет значение для проведения дифференциальной диагностики с другими дерматозами [37]. Проведение секвенирования у больного буллезным эпидер- молизом позволяет выявить тип и локализацию мутации, а также тип наследования заболевания (см. табл. 2) [38]. Данная диагностика имеет большое значение не только у больных буллезным эпидермолизом, но и позволяет исследовать мутационный профиль пациента при проведении пренатальной и предимплантационной диагностики, при процедуре экстракорпорального оплодотворения в семьях, имеющих детей с буллезным эпидермолизом. Постановка точного генетического диагноза имеет значение для определения последующей терапии заболевания, в частности проведения генной терапии, при которой вводят ген, кодирующий поврежденный белок. Метод осуществляют путем пересадки участка кожи с исправленным геном. При дистрофическом буллезном эпидер- молизе применяют терапию рекомбинантным человеческим коллагеном типа IV [39]. Нейрофиброматоз представляет собой еще одну группу наследственных заболеваний, связанных с поражениями кожи, а также изменениями в нервной системе и других органах. С учетом наличия у ряда пациентов минимальной клинической симптоматики, молекулярная диагностика нейрофиброматоза 1-го типа является актуальной, но чрезвычайно сложной задачей. Последнее связано с большими размерами гена NF1 , в котором происходит мутация при данном заболевании, а также отсутствием мутаций в «горячих точках», отсутствием кластеризации мутаций [40]. Технология NGS в отличие от секвениро- вания по Сэнгеру позволяет проводить выявление муль- тиэкзомных делеций и дупликаций. Благодаря методу NGS была выявлена 21 мутация в данном гене [41], что позволяет рассматривать данный способ секвенирования как эффективный метод, позволяющий улучшить генодиагностику данного заболевания. Применение метода секвенирования имеет свою актуальность в трихологии. С помощью секвенирования были выявлены мутации в гене HR (human hairless homolog), отвечающие за возникновением алопеции у больных папулезной атрихией. Особенностью данного вида мутаций является то, что они разрушают «открытые рамки считывания» (upstream open reading frames, uORF) внутри не- транслируемой области (5’-UTR) гена, кодирующего HR- белок, продукт HR-гена. Данный генетический дефект приводит к разрушению регуляции системы экспрессии гена и возникновению данной разновидности аллопеции, которая проявляется папулезными повреждениями большого процента поверхности кожи тела и практически полным отсутствием волос [42]. Выявление мутации в гене HR позволяет классифицировать врожденные формы атрихии с учетом фенотипических и генотипических признаков заболевания. Методы генетической диагностики являются важными составляющими в постановке дерматологического диагноза, а также расширяют возможности для персонифицированной терапии больных. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ---- ЛИТЕРАТУРА-----------------------------------------------------------

About the authors

Maria B. Aksenenko

Krasnoyarsk State Medical University

Email: aksenenko_mariya@mail.ru
Candidate of Medical Sciences, Docent, Department of Pathophysiology with a Course of a Clinical Pathophysiology 660022, Krasnoyarsk, Russia

T. G Ruksha

Krasnoyarsk State Medical University

660022, Krasnoyarsk, Russia

References

Supplementary files