Роль CD45RA +, CD45RO +-лимфоцитов в патогенезе псориаза

Полный текст

Организм человека отделен от окружающей его среды барьерами, основными из которых являются кожа и слизистые оболочки. Знание структуры и анатомии покровных тканей имеет большое значение для понимания функционирования иммунной системы. Значительная часть респираторного тракта, мочевыводящей системы и кишечника на границе с внешней средой имеет всего один слой клеток, покрытых защитным слизистым секретом. Устойчивость слизистых оболочек к инвазии патогенов существенно возрастает благодаря высокому содержанию в слизи разнообразных неспецифических антимикробных защитных факторов (лизоцим, антимикробные пептиды, лактоферрин и др.) и специфических антител — IgA, производимых плазмоцитами. Иммунная система слизистых оболочек представлена ассоциированной с ней лимфоидной тканью (MALT — mucosa-associated lymphoid tissue), включающей лимфоидные фолликулы и мезентериальные лимфатические узлы. В этих лимфоидных структурах преобладают В-лимфоциты, являющиеся источником IgA, а также имеются зоны, содержащие Т-клетки. Морфофункциональную структуру кожи, включающую антигенпрезентирующие клетки (АПК), лим фоциты, кератиноциты, фибробласты, эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов, рассматривают как единую систему — лимфоидную ткань, ассоциированную с кожей (SALT — skin-associated lymphoid tissue) [1, 2]. Многослойное строение эпидермиса, его ороговение, непроницаемость для воды и дефицит влаги на поверхности создает условия, неблагоприятные для реализации в коже гуморального иммунного ответа. В развитии специфического воспалительного процесса при различных дерматозах участвует преимущественно клеточное звено иммунитета. Первичный контакт наивных Т-клеток с антигеном, представленным АПК сопровождается их клональной экспансией и дифференцировкой в различные субпопуляции эффекторных клеток. После созревания Т-клеток у них формируется определенный фенотип и экспрессируется характерная комбинация цитокинов. Фенотипическим признаком дифференцировки наивных Т-лимфоцитов принято считать появление на поверхности клеток изоформы CD45RО взамен изоформы CD45RA [3]. После развития иммунного ответа большинство активированных лимфоцитов элиминируется путем программируемой клеточной гибели, часть (5—10%) антигенспецифических В- и Т-клеток остается в организме, формируя иммунологическую память [4]. Некоторые исследователи предполагают появление клона T-клеток памяти в результате асимметричного деления наивных Т-лимфоцитов [5]. Повторный контакт клеток памяти с антигеном приводит к развитию более быстрой иммунной реакции за счет пролиферации и образования клона клеток-эффекторов или продукции антител. Для активации клеток памяти требуются более низкие дозы антигена, чем для примирования наивных Т-лимфоцитов [6]. Среди Т-клеток памяти выделяют субпопуляцию эффекторных (effector memory T cells — TEM) и центральных Т-клеток памяти (central memory T cells — T ). TEM при контакте с антигеном способны к немедленной реактивации и реализации своих эффекторных функций, приобретенных ранее в процессе дифференцировки. TCM после антигенной стимуляции интенсивно пролиферируют, что приводит к значительному увеличению их численности и быстрой генерации новых антигенспеци-фических Т-лимфоцитов [7]. Предполагалось, что TEM локализованы в периферических нелимфоидных тканях для непосредственного осуществления защитных функций, а TCM находятся во вторичных лимфоидных органах, являясь резервом антиген-специфических клеток. TEM отличаются тканеспеци-фичностью благодаря экспрессии на их поверхности хоуминговых (homing — возвращающийся домой) молекул — рецепторов, лиганды к которым имеются только в определенных типах тканей: коже, слизистой оболочке кишечника, легких и др. Результаты последних исследований показали возможность рециркуляции клеток памяти между лимфоидными и нелимфоидными органами благодаря изменению фенотипа с TEM (CD45RO+CCR7—CD62L—) на TCM (CD45RO+CCR7+Cd62L+) и обратно. Последовательная экспрессия различных хоуминговых рецепторов на поверхности Т-клеток памяти позволяет им покидать кожу, в которой развился иммунный ответ, мигрировать в лимфатические узлы или другие лимфоидные образования и возвращаться назад [8]. TEM могут присутствовать в периферических тканях не только при наличии в них воспаления, но и при его отсутствии. Они составляют до 95% всех лимфоцитов кожи и имеют фенотип CD3+CLA+CD45RO+. Количество T в коже у здорового человека в 2 раза превышает таковое в периферической крови. Эти клетки перемещаются на границе с внешней средой и постоянно осуществляют скрининг патогенов [9]. Роль иммунологической памяти при некоторых заболеваниях может иметь негативное значение. Клетки памяти, образованные в результате нарушения толерантности к собственным антигенам, в дальнейшем могут приводить к развитию аутоиммунных заболеваний, инициируя иммунное воспаление. Псориаз является хроническим иммунозависимым дерматозом, в патогенезе которого основную роль играет формирование Т-клеточного иммунного ответа, провоцирующего развитие аутоиммунного воспаления. Нарушения иммунологической памяти могут играть важную роль в развитии псориаза [4, 10]. Цель настоящего исследования — изучение численности субпопуляций CD45RA+- CD45RO+-клеток и пролиферативной активности клеток кожи у больных псориазом в разные периоды заболевания. Материалы и методы В группу исследования вошел 41 больной вульгарным псориазом (средний возраст 43,2 ± 1,84 года). Все пациенты подписали информированное согласие. Получено разрешение Комитета по вопросам этики при ФГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова на проведение исследования. Группу контроля составили 16 здоровых лиц (средний возраст 39,4 ± 2,62 года). Все пациенты получали общую гипосенсибилизирующую терапию, сосудистые препараты, витамины, наружное лечение. Объектами исследования были пораженные участки кожи больных псориазом в прогрессирующем периоде (папулы), больных псориазом в период ремиссии (вторичные пятна), здоровых лиц (получены после пластических операций), взятые методом панч-биопсии (6 мм). Повторная биопсия кожи была выполнена 18 больным в период ремиссии. Для иммуногистохимической детекции лимфоцитов, пролиферативной активности клеток и их устойчивости к апоптозу использовали первичные мышиные и кроличьи моноклональные и поликлональные античеловеческие антитела к CD45RO (UCHL1), Bcl-2 (124), Bcl-6 (PG-B6p), Ki-67 (MIB1) ("Dako", Дания), CD45RA (4KB5), ^3ε — Ki-67 (№3ε — F7.2.38; Ki-67 — SP6) ("Thermo Fisher Scientific", США), систему визуализации Envision ("Dako", Дания) и Multivision Polymer ("Thermo Fisher Scientific", США). Количество окрашенных цветовой меткой (позитивных) клеток определяли при 200-кратном увеличении светового микроскопа в трех полях зрения (размером 720 X 530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых клеток, используя компьютерную программу анализа изображения UTHSCSA ImageTool 3.0. Полученные данные представлены в виде среднего количества (медианы) позитивных клеток на изучаемой площади среза (0,38 мкм2). Данные статистически обрабатывали с помощью программы SPSS 13.0 for Windows (SPSS, Inc). В случае отклонения от Рис. 1. Субпопуляция CD45RO+-лимфоцитов в коже человека. Иммуногистохимическое исследование. Для детекции позитивных клеток использовали хромоген диаминобензидин (темно-коричневое окрашивание). Ув. 200. Здесь и на рис. 2: а — кожа больного псориазом, прогрессирующий период; б — кожа больного псориазом на месте разрешившихся высыпаний в период ремиссии; в — кожа здорового человека. 32 № 6, 2012 нормального распределения для сравнения данных применяли U-критерий Манна—Уитни, при нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента. Для выявления взаимосвязи между показателями рассчитывали коэффициент (r) ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считали различия приp < 0,05. Результаты и обсуждение Основные результаты анализа количества клеток в коже у больных псориазом в прогрессирующий период, ремиссию и здоровых людей представлены в таблице. Морфологические изменения кожи больных псориазом в прогрессирующий период характеризовались увеличением толщины эпидермиса — 454 мкм по сравнению с аналогичными показателями у пациентов в период ремиссии — 167 мкм (p < 0,01) и у здоровых лиц — 88 мкм (p < 0,01), а также высокой пролиферативной активностью клеток эпидермиса и дермы. Маркеры пролиферации и программируемой клеточной гибели: Ki-67+, CD3ε+Ki-67+, Bcl-2+, Bcl-6. В коже больных псориазом в прогрессирующий период белок Ki-67 интенсивно экспрессировался в кера-тиноцитах базального и нижних рядов шиповатого слоя эпидермиса, а также в клетках дермального инфильтрата (рис. 1, а—в). Уровень Ki-67+-кератиноцитов в прогрессирующий период псориаза — 247 (189—339) в поле зрения, в 6,9 раза превышал аналогичный показатель в ремиссию — 36 (23—52) и был в 13,7 раза выше, чем у здоровых лиц — 18 (14—33) в поле зрения (p < 0,01 при каждом сравнении). &-67+-клетки у пациентов с псориазом в оба периода обнаруживали в дерме преимущественно в составе периваскулярных инфильтратов. У здоровых людей встречали единичные дермальные &-67+-клетки, имеющие морфологическое сходство с фибробластами и эндотелием сосудов. Различия в количестве дермальных Еі-67+-клеток в коже больных псориазом в прогрессирующий период, ремиссию и у здоровых людей — 40 (22—54), 7 (4—13), 3 (2—6) в поле зрения соответственно — также были статистически значимы (p < 0,01 при каждом сравнении). Отношение Ki-67+-клеток дермы к Ki-67+-клеткам эпидермиса в прогрессирующий период псориаза составило 0,21, в ремиссию — 0,18, у здоровых людей — 0,09. Система визуализации двух антигенов в одном срезе позволила определить, что около % всех пролиферирующих клеток дермы в прогрессирующий период псориаза составили Т-лимфоциты (CD3ε+Ki-67+) — 11 (7—14) в поле зрения, что было выше, чем в ремиссию — 2 (1—3) (p < 0,01). У здоровых людей CD3ε+Ki-67+-клетки в коже не встречались (рис. 2, а, б). В биоптатах всех групп антиапоптотический белок Bcl-2 обнаруживали в клеточных дермальных инфильтратах и единичных клетках (морфологически сходны с меланоцитами), располагающихся в базальном слое эпидермиса. Количество Веі-2+-клеток у больных псориазом в прогрессирующий период — 159 (104—221) в поле зрения оказалось в 2,8 раза больше, чем у пациентов в период ремиссии — 57 (41—86), и в 13,2 раза больше, чем у здоровых людей — 12 (11—24) (p < 0,01 при каждом сравнении). 33 РОССИЙСКИЙ ЖУРНАЛ КОЖНЫХ И ВЕНЕРИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ Рис. 2. Субпопуляция CD45RА+-лимфоцитов в коже человека. Иммуногистохимическое исследование. Для детекции позитивных клеток использовали хромоген диаминобензидин (темно-коричневое окрашивание). Ув. 200. Белок Bcl-6 интенсивно экспрессировался в ядрах шиповатых кератиноцитов больных псориазом и здоровых людей. Были подсчитаны только клетки дермы, позитивные по Bcl-6. Наиболее высокую экспрессию Bcl-6 отмечали в коже больных псориазом в прогрессирующий период — 76 (53—101), в ремиссию псориаза — 11 (8—15), у здоровых людей Веі-6+-клетки практически не встречали — 2 (1—3) в поле зрения (p < 0,01 при каждом сравнении). Количество CD45RO+-клеток в коже больных псориазом в прогрессирующий период было в 3,7 раза больше, чем в ремиссию, и в 14 раз больше, чем в коже здоровых людей. Эти клетки локализовались в сосочковой части дермы у больных псориазом в прогрессирующий период (87%), в ремиссию (93%), у здоровых лиц (97%) и эпидермисе — в 13, 7 и 3% соответственно. CD45RA+-лимфоциты практически не встречали в коже здоровых людей, в то время как у больных псориазом в прогрессирующий период их было 26 (15—31) в поле зрения. CD45RA+-клетки располагались преимущественно (96%) в дерме в составе клеточных инфильтратов. При проведении корреляционного анализа у больных псориазом выявили сильную прямую связь между PASI (Psoriasis area and severity index — индекс активности и распространенности поражения при псориазе) и количеством &-67+-клеток в эпидермисе (r = 0,736; p < 0,01), PASI и количеством CD45RA+-клеток (r = 0,719; р < 0,01), PASI и количеством Веі-6+-клеток в эпидермисе (r = 0,714; p < 0,01), количеством Ki-67+-клеток в эпидермисе и количеством Еі-67+-клеток в дерме (r = 0,709; p < 0,01), умеренную прямую связь Рис. 3. Кожа больного псориазом в прогрессирующий период. Иммуногистохимическое исследование. Двойная система детекции: синее окрашивание — маркер Ki-67, красное — маркер CD3ε, стрелками показаны двойные позитивные (CD3ε+Ki-67+) клетки — пролиферирующие Т-лимфоциты. Ув. 400. между PASI и количеством CD45RO+-клеток (r = 0,554; р < 0,01), PASI и количеством Еі-67+-клеток в дерме (r = 0,473;р < 0,01). Определили сильную прямую связь между количеством CD45RO+-клеток и ко -личеством &-67+-клеток в дерме (r = 0,847; p < 0,01), количеством CD45RO+-клеток и количеством Ki-67+-клеток в эпидермисе (r = 0,701; р < 0,01), умеренную прямую связь между количеством CD45RO+-клеток и PASI (r = 0,403;р < 0,01). У больных псориазом в прогрессирующем периоде в состав клеточного воспалительного инфильтрата в основании псориатической папулы входит значительное количество CD45RO+-клеток, встречаются CD45RА+-клеток и Веі-6+-клетки. Большое количество CD45RO+-клеток в области псориати-ческих высыпаний в прогрессирующий период заболевания обусловлено присутствием эффекторных Т-лимфоцитов. При затихании процесса воспаления значительная часть активированных Т-клеток элиминируется путем апоптоза, а часть остается в коже, дифференцируясь в TM. В результате корреляционного анализа выявили сильную прямую зависимость между количеством CD45RO+-клеток и пролифера-тивной активностью клеток эпидермиса. Эти данные могут свидетельствовать об усилении пролиферации кератиноцитов за счет увеличения количеством клеток-эффекторов, продуцирующих медиаторы воспаления. Присутствие CD45RА+-клеток может являться результатом рекрутирования из периферической крови наивных Т-лимфоцитов. Отметили высокую про-лиферативную активность клеток дермального инфильтрата и экспрессию антиапоптозного белка Bcl-2. Высокий уровень экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2, который обычно наблюдается в клетках Т-зоны лимфоидных фолликулов, при псориазе в разгар воспаления необходим для обеспечения деления клеток и преждевременной гибели эффекторных лимфоцитов, а в период ремиссии он создает условие для длительного выживания Т-клеток памяти. С помощью иммуногистохимического метода двойной метки мы установили, что Т-лимфоциты могут делиться в коже больных псориазом, в прогрессирующий период заболевания CD3ε+Ki-67+-клетки составляют около 30% всех пролиферирующих клеток дермы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что образование клеточного инфильтрата в коже больных псориазом может происходить за счет не только миграции иммунокомпетентных клеток из периферической крови, но и интрадермальной пролиферации (рис. 3). 34 № 6, 2012 Мы обнаружили дермальные Bcl-6+-клетки у больных псориазом. Идентифицировать эти клетки по одному маркеру не представляется возможным. Можно предположить, что обнаруженные в коже Bcl-6+-клетки представляют Tfh-подобные (follicular helper T cells — Tfh) лимфоциты. Tfh-клетки представляют особую субпопуляцию Т-лимфоцитов, которая образуется в герминативных центрах лимфатических узлов. Наиболее изученной функцией Tfh-клеток является участие в дифференциров-ке В-лимфоцитов, но в коже больных псориазом В-клетки практически не встречаются [11]. Результаты недавних исследований показали, что Tfh-клетки могут локализоваться экстрафолликулярно и обладают рядом свойств, характерных для других субпопуляций Т-лимфоцитов. Обсуждается концепция, согласно которой Tfh-клетки не являются терминальным этапом дифференцировки лимфоцитов, а могут представлять промежуточное звено плюри-потентных Т-клеток [12, 13]. Bcl-6+-клетки могут продуцировать интерлейкин (IL) 21, который участвует в дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Т-хелперы 17-го типа (Th 17). IL-21-зависимый путь образования Th17 является альтернативным и происходит при отсутствии IL-6. Во вторичных лимфоидных органах источником IL-6 являются фолликулярные дендритные клетки (ДК), в коже больных псориазом они отсутствуют [14]. Белок Bcl-6 специфичен для Tfh-клеток, но его экспрессия может наблюдаться в ДК в процессе их созревания. Стимуляция ДК моноцитарного происхождения различными антигенами вызывает непродолжительную экспрессию Bcl-6 [15]. При геномном анализе установили, что Bcl-6 регулирует транскрипцию ряда генов, ко -дирующих воспалительные цитокины и хемокины [16]. Поэтому нельзя исключить того, что обнаруженные Bcl-6+-клетки относятся к ДК. Значительные различия в количестве Bcl-6+-клеток у больных псориазом в прогрессирующий период, ремиссию и у здоровых людей свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований этого фактора транскрипции. Мы обнаружили, что у больных псориазом в ремиссию в коже на месте разрешившихся псориати-ческих высыпаний сохраняется избыточное количество CD45RO+-клеток по сравнению с таковым в коже здоровых людей,. Эти клетки могут представлять субпопуляцию TEM, которые остаются после окончания иммунного ответа и формируют иммунологическую память. При последующих рецидивах псориаза эти клетки реактивируются и принимают участие в развитии воспаления. Возможно, что CD45RO+-клетки кожи больных псориазом при вторичном иммунном ответе в присутствии зрелых АПК ведут себя как TCM, реагируя на антигенную стимуляцию пролиферацией, приводящей к увеличению количества эффекторных клеток. Данная работа посвящена исследованию роли иммунной системы кожи в патогенезе псориаза. Мы рассматриваем кожу больных псориазом с позиции периферического лимфоидного органа, в котором доминирует Т-клеточное звено. Возможно, что уча стие SALT в реализации адаптивного иммунитета не ограничивается распознаванием патогена и его презентацией в лимфатических узлах. В коже больных псориазом в прогрессирующий период клеточный инфильтрат может формировать организованные структуры, которые способны частично выполнять функции вторичных лимфоидных органов. В частности, мы продемонстрировали возможность пролиферации Т-лимфоцитов в дермальных инфильтратах, расположенных в основании псориатических папул. Результаты проведенного исследования позволят расширить наши представления о механизмах развития псориаза и иммунологических свойствах кожи.

Об авторах

В. Р. Хайрутдинов

ФГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: haric03@list.ru
канд. мед. наук, ассистент

А. Ф. Михайличенко

ФГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: dr_nastya@mail.ru
ст. лаборант

А. Л. Пискунова

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: annakmp@mail.ru
аспирант

М. С. Мухина

Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Росмедтехнологий

Email: mukhina.mar@yandex.ru
канд. мед. наук, ст. науч. сотр.

Г. Н. Тарасенко

ФГКУ 3-й Центральный военный клинический госпиталь им. А. А. Вишневского Минобороны России

Email: drtarasenko@yandex.ru
канд. мед. наук, доцент

А. В. Самцов

ФГОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Email: avsamtsov@mail.ru
д-р мед. наук, проф.

Список литературы

Дополнительные файлы