Оценка частоты HLA-DRB1 аллелей у больных истинной акантолитической пузырчаткой в российской популяции

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

В основе развития истинной акантолитической пузырчатки (ИАП) лежат генетические, гормональные, иммунологические факторы, а также факторы окружающей среды. Как и многие другие аутоиммунные заболевания, ИАП принадлежит к группе полигенного наследования с фенотипами, возникающими в результате изменений в различных генах, кодирующих молекулы, вовлечённых в регуляцию иммунной системы [1, 2]. Однако, по данным множества авторитетных исследований, HLA аллели II класса являются одними из ключевых пусковых механизмов развития заболевания [3, 4].

Человеческие лейкоцитарные антигены (human leukocyte antigens, HLA) представляют собой главный комплекс гистосовместимости, состоящий более чем из 150 антигенов. Локус, расположенный на 6-й хромосоме, содержит большое количество генов, связанных с иммунной системой. Здесь также кодируются антигенпрезентирующие белки. HLA II класса представляют антигены из внеклеточного пространства T-лимфоцитам. Они активируют B-клетки к выработке аутоантител к данному антигену [5].

Частота различных HLA аллелей II класса при ИАП оценивалась в итальянской, китайской, японской, британской, словацкой, иранской, аргентинской и других популяциях [6]. Положительные ассоциации с ИАП в большинстве своём наблюдали у носителей DR4 и DR14 аллелей. Однако наличие предрасполагающих аллелей зависит от этноса пациентов [3]. Следует отметить, что HLA аллели II класса в российской популяции до сих пор не изучались.

Цель исследования ― изучение частоты DRB1 аллелей у больных ИАП в российской популяции.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование случай-контроль. Дизайн исследования представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Дизайн исследования. ИАП ― истинная акантолитическая пузырчатка.

 

Первичная конечная точка ― выявление различий в HLA аллелях DRB1 II класса у больных ИАП и здоровых доноров. Промежуточных конечных точек нет.

Критерии соответствия

Критерии включения: подтверждённый гистологически и иммуногистохимически диагноз ИАП; больные ИАП старше 18 лет.

Критерии исключения: отказ пациента от участия в исследовании.

Условия проведения

Кафедра кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет); кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; Центр крови ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Исследование выполнено в период с 2016 по 2021 г.

Описание медицинского вмешательства

Все больные ИАП получали начальную дозу системных глюкокортикостероидов 80–100 мг/сут с последующим медленным снижением, согласно клиническим рекомендациям.

Исходы исследования

Основной исход исследования: в нашем исследовании летальных исходов, а также тяжёлых осложнений у больных ИАП не наблюдалось. Основным исходом исследования было выявление различий по частоте DRB1 аллелей у больных ИАП и здоровых доноров.

Анализ в подгруппах

Группа больных ИАП состояла из 48 (67,6%) женщин и 23 (32,4%) мужчин. Средний возраст больных составил 52±15 лет. Группа контроля состояла из 40 (43,5%) мужчин и 52 (56,5%) женщин. Средний возраст здоровых доноров составил 51±7 лет. Не могли назвать фактор дебюта 68% больных ИАП, 11% связывали развитие заболевания со стрессом, 4,2% ― с приёмом лекарственных средств, 2,9% ― с онкологическими процессами, 5,6 и 2,8% ― с беременностью и перенесённой острой респираторной вирусной инфекцией соответственно; наименьшее число ответов приходилось на химические агенты, инсоляцию, травму и протезирование зубов (рис. 2).

 

Рис. 2. Распределение факторов дебюта истинной акантолитической пузырчатки, %.

 

Методы регистрации исходов

У всех испытуемых был получен один образец крови для HLA-типирования DRB1 аллелей в низком уровне разрешения, при котором исследовалась частота DRB3, DRB4, DRB7, DRB11, DRB12, DRB13, DRB14 и DRB15 аллелей с помощью набора Qiagen QIAamp DNAMini Kit (Германия). HLA-типирование для DRB1 проводилось с помощью экстракции 50 нанограмм ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением специфичных праймеров (HISTOTYPE SSP Kits, BAG, Германия; AllSet+TM Gold SSP Typing Kits, Invitrogen Corp., Madison, Wi, США). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Полученные изображения проанализированы с помощью программного обеспечения HISTO MATCH.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено этическим комитетом Сеченовского Университета (выписка из протокола № 03-22 от 03.02.2022), а также зарегистрировано в международной базе исследований ClinicalTrials.gov (Identifier: NCT05284929).

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Частоту аллелей HLA подсчитывали непосредственно из полученных данных генотипирования с помощью алгоритма максимизации ожидания и использованием программного пакета ARLEQUIN (версия 3.11), что позволило оценить максимально точно частоту генов. Для сравнения различий между частотами в группах здоровых доноров и пациентов был проведён анализ табл. 1 с помощью критерия Фишера. Силу связи между аллелями HLA и ИАП оценивали по отношению шансов (ОШ) и 95% доверительному интервалу (ДИ). Статистически значимым считалось p-value <0,01. Значения p были скорректированы для множественных сравнений по методу Бенджамини–Хохберга.

 

Таблица 1. Распределение частоты DRB1-HLA аллелей в низком разрешении у больных пузырчаткой и здоровых доноров

Table 1. Frequency distribution of DRB1-HLA alleles at low resolution level in patients with pemphigus and healthy controls

DRB1	Пациенты, n=70 (%)	Здоровые доноры, n=92 (%)	Отношение шансов (ОШ)		Доверительный интервал (ДИ)		p
			Пациенты	Здоровые доноры	Пациенты	Здоровые доноры
1	3 (4,3)	9 (9,8)	0,64	1,29	0,27–1,49	0,9–1,85	0,2
3	2 (2,9)	8 (8,7)	0,56	1,36	0,21–1,51	0,95–1,94	0,2
4	29 (41,4)	8 (8,7)	2,33	0,34	1,72–3,14	0,19–0,62	0,000001
7	3 (4,3)	6 (6,5)	0,83	1,13	0,37–1,85	0,71–1,81	0,7
11	3 (4,3)	20 (21,7)	0,33	1,62	0,13–0,83	1,28–2,05	0,001
12	1 (1,4)	6 (6,5)	0,5	1,4	0,15–1,71	0,96–2,05	0,1
13	6 (8,6)	11 (12)	0,83	1,13	0,45–1,54	0,78–1,64	0,6
14	19 (27,1)	6 (6,5)	1,98	0,41	1,45–2,7	0,22–0,79	0,0004
15	4 (5,7)	18 (19,6)	0,44	1,5	0,2–0,98	1,16–1,94	0,01

Примечание. Полужирным шрифтом выделены статистически значимые показатели.

Note: Statistically significant values are highlighted in bold.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследовании принимали участие 70 больных ИАП и 92 здоровых донора. Диагноз ИАП был подтверждён гистологически и иммуногистохимически. Средний возраст больных составил 52±15 лет, здоровых доноров ― 51±7 лет.

Основные результаты исследования

Установлено, что DRB1*4 аллели встречались статистически значимо чаще в группе больных ИАП (41,4%; ОШ=2,33) в сравнении со здоровыми донорами (8,7%; ОШ=0,34; p=0,000001). DRB1*14 аллели также статистически значимо чаще встречались у больных ИАП (27,1%; ОШ=1,98) по сравнению со здоровыми донорами (6,5%; ОШ=0,41; p=0,0004), тогда как DRB1*11, наоборот, достоверно чаще встречались у здоровых доноров (21,7%; ОШ=1,62) в сравнении с больными ИАП (4,3%; ОШ=0,33). DRB1*15 также статистически значимо чаще встречались в группе контроля (19,6%; ОШ=1,5) по сравнению с группой пациентов (5,7%; ОШ=0,44; p=0,01); см. табл. 1.

Дополнительные результаты исследования

Дополнительных исходов исследования не было.

Нежелательные явления

В ходе исследования нежелательных явлений не отмечено.

ОБСУЖДЕНИЕ

Недостатком исследования случай-контроль могут быть систематические ошибки.

Резюме основного результата исследования

В нашем исследовании мы впервые оценили частоту DRB1, DRB3, DRB4, DRB7, DRB11, DRB12, DRB13, DRB14 и DRB15 HLA аллелей в российской популяции с помощью метода секвенирования в низком разрешении. Полученные данные свидетельствуют о том, что предрасполагающими аллелями для развития заболевания являлись HLA-DRB1*4 и DRB1*14, в то время как HLA-DRB1*11 и DRB*15 ― протективными, т.е. при наличии последних вероятность развития ИАП у того или иного индивида будет крайне низкой.

Обсуждение основного результата исследования

Впервые в нашем исследовании мы оценили частоту аллелей человеческого лейкоцитарного антигена II класса DRB1 у больных ИАП в российской популяции. В настоящее время существует достаточно большое количество исследований, демонстрирующих, что различные HLA антигены или аллели являются предрасполагающими к развитию ИАП, тогда как другие играют протективную роль [3, 7, 8].

Интересно, что ассоциации DRB1*04:02, DRB1*14:01 и DRB1*14:04 аллелей с ИАП являются наиболее часто встречающимися во всём мире [3, 7, 9, 10]. C.M. Veldman и соавт. [11] в своём исследовании продемонстрировали, что антигенпрезентирующие клетки, экспрессирующие HLA-DRB1*04:02 или DQB1*05:03 аллели, были ответственны за представление десмоглеина 3 (Дсг3) аутореактивными CD4+ Т-клеточным клонам. D. Zivanovic и соавт. [6] в своём исследовании, определяя частоту DRB*04 и DRB*14 аллелей у больных ИАП в сербской популяции, также показали, что DRB1*04:02, DQB1*03:02 и DQB1*05:03 аллели являлись предрасполагающими к развитию заболевания. Более 90% евреев-ашкенази, у которых развивается ИАП, являются носителями DRB1*0402 аллели [12].

Этот механизм вносит большой вклад в патофизиологию заболевания. Однако такая способность презентации антигенных пептидов Дсг3 для большинства молекул HLA изучена недостаточно. Остаётся неясным, могут ли антигенпрезентирующие клетки, экспрессирующие наиболее часто встречающие HLA молекулы, запускать аутореактивный ответ, поскольку часть таких пациентов являются также носителями и других аллелей, например DQB*05:03 или DQB1*03:1 [13]. Более того, у больных ИАП с выявленной DRB1*0402 аллелью главный комплекс гистосовместимости HLA II класса может формировать комплекс с одним или двумя пептидами, полученными путём процессинга молекулы клеточной адгезии Дсг3. Это специфичное пептидное взаимодействие детерминировано первичной заменой аминокислот в 70-й и 71-й позициях. Сформированный пептидный комплекс в последующем стимулирует специфические Т-клетки, секретирующие цитокины. Этот механизм запускает продукцию Дсг3-специфичных аутоантител, направленных на молекулы адгезии кератиноцитов, что клинически проявляется формированием интраэпидермального пузыря [12]. Таким образом, целью нашей работы явилась оценка наиболее релевантных для развития ИАП аллелей, вносящих огромный вклад в развитие акантолиза у таких больных.

Согласно нескольким исследованиям, Дсг-специфические Т-клетки, полученные in vitro у больных ИАП, не только распознавали несколько фрагментов внеклеточных частей Дсг у одного и того же пациента, но и преобладающий эпитоп авторам выявить так и не удалось [11, 14, 15].

Две гипотезы могут объяснить это наблюдение. Первая говорит о том, что первоначальный ответ Т-клеток может быть ограничен одной детерминантой, но впоследствии может происходить их распространение, что приводит к разнообразному репертуару эпитопов/пептидов [16, 17]. Вторая гипотеза утверждает, что инициирование заболевания запускается несколькими пептидами, полученными из одного и того же белка. Идентификация пептидов, стимулирующих Т-клетки, полученных из Дсг, может стать ключевым шагом на пути к разработке терапевтических стратегий предотвращения их распознавания Т-клетками, тем самым препятствуя продукции аутоантител и повреждению тканей при тяжёлых аутоиммунных буллёзных дерматозах [7].

Ограничения исследования

Из ограничений можно отметить недостаточно большой объём выборки больных, что не исключает появления систематических ошибок в исследовании случай-контроль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, согласно нашему исследованию, HLA-DRB1*4 и DRB1*14 аллели статистически значимо чаще выявлялись у больных ИАП по сравнению со здоровыми донорами и могли бы рассматриваться в качестве потенциальных генетических биомаркеров, предрасполагающих к развитию заболевания, в то время как HLA-DRB1*11 и DRB*15 аллели, наоборот, достоверно чаще встречались в группе здоровых доноров и, следовательно, являлись защитными для российской популяции. Однако для оценки частоты тех или иных HLA аллелей необходимы дальнейшие исследования на большей выборке больных, поскольку DR-молекулы полиморфны.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.А. Лепехова ― написание статьи, обзор литературы, статистическая обработка, анализ групп исследования; О.Ю. Олисова ― поисково-аналитическая работа, наблюдение за больными истинной акантолитической пузырчаткой, одобрение направления рукописи на публикацию, критический анализ исследования; Н.Л. Шимановский ― лабораторные исследования HLA методами секвенирования и ПЦР, критический анализ исследования; А.С. Духанин ― лабораторные исследования HLA методами секвенирования и ПЦР, критический анализ исследования, интерпретация и оценка полученных результатов; Н.П. Теплюк ― критический анализ исследования, наблюдение за больными истинной акантолитической пузырчаткой, оценка полученных результатов.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The research was carried out at the expense of the organization’s budgetary funds.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors contribution. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis of literature, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. A.A. Lepekhova ― writing an article, literature review, statistical processing, analysis of study groups; O.Y. Olisova ― search and analytical work, observation of patients with true acantholytic pemphigus, approval of the direction of the manuscript for publication, critical analysis of the study; N.L. Shimanovsky ― conducting HLA research methods in the laboratory (sequencing, PCR), critical analysis of the study; A.S. Dukhanin ― conducting HLA research methods in the laboratory (sequencing, PCR), critical analysis of the study, interpretation and evaluation of the results; N.P. Teplyuk ― critical analysis of the study, observation of patients with true acantholytic pemphigus, evaluation of the results obtained.

Об авторах

Ольга Юрьевна Олисова

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: olisovaolga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2482-1754
SPIN-код: 2500-7989

д.м.н., профессор

Россия, Москва

Николай Львович Шимановский

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Email: shiman@rsmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-8887-4420
SPIN-код: 5232-8230

д.м.н., профессор, член-корр. РАН

Россия, Москва

Александр Сергеевич Духанин

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова

Email: das03@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-2433-7727
SPIN-код: 5028-6000

д.м.н., профессор

Россия, Москва

Наталия Павловна Теплюк

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: teplyukn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5800-4800
SPIN-код: 8013-3256

д.м.н., профессор

Россия, Москва

Анфиса Александровна Лепехова

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: anfisa.lepehova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4365-3090
SPIN-код: 3261-3520

к.м.н., доцент

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы