THE RELATION BETWEEN THE CONTENT OF PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILS AND THE BLOOD RELEASED FROM THE SURFACE OF PSORIATIC PAPULA

Full Text

Нейтрофилы традиционно относятся к фагоцитирующим клеткам, которые благодаря ряду уникальных свойств рассматриваются как высокопрофессиональные «убийцы», составляющие своеобразный «отряд быстрого реагирования» в системе противоинфекционной защиты организма [1, 2]. Нейтрофилы обладают всеми функциями фагоцитирующих клеток: адгезивностью, подвижностью, способностью к хемотаксису и захвату бактерий и других частиц, убивая и «переваривая» захваченные микроорганизмы с помощью кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов [3, 4]. Имеются свидетельства роли нейтрофилов в представлении антигенов моноцитам и лимфоцитам, а также их возможности регулировать функции иммунокомпетентных клеток через продукцию цитокинов [5]. Инфильтрация нейтрофилами эпидермиса при псориазе, при котором гиперпролиферация кератиноцитов опосредована активированными Т-лимфоцитами, служит еще одним свидетельством многогранности функций нейтрофилов [6-8]. Уникальность псориаза, как модели для изучения миграции нейтрофилов, заключается в том, что инфильтрация нейтрофилами эпидермиса происходит при отсутствии инфекционного фактора в зоне пораженной кожи [9, 10]. Кроме того, механизмы регуляции миграционной активности нейтрофильных лейкоцитов в кожу при псориазе представляют теоретический и практический интерес, поскольку с высокой интенсивностью инфильтрации нейтрофилами эпидермиса связано более тяжелое течение заболевания [6, 8, 11]. Известно, что пул нейтрофилов крови включает в себя циркулирующий и маргинальный, а миграция нейтрофилов через эндотелий сосудов регулируется молекулами адгезии [12]. Процесс миграции нейтрофилов в ткани трехступенчатый, включающий скольжение - «роллинг» нейтрофильных лейкоцитов по поверхности эндотелия, последующей прочной адгезией и трансмиграцией через эндотелий [13, 14]. Роллинг нейтрофилов опосредуется низкоаффинными рецепторами, в том числе L-селектинами [12]. Фаза прочной адгезии реализуется с участием молекул LFA-1, LFA-3, ICAM-1 [14]. Собственно, миграция нейтрофилов, как, впрочем, и других лейкоцитов через эндотелий, связана с экспрессией молекул PECAM [13]. Учитывая то, что роль нейтрофилов в патогенезе псориаза не совсем ясна, фактически нет сведений относительно зависимости уровня экспрессии молекул адгезии циркулирующего пула нейтрофилов от их морфологических изменений, цель исследования состояла в изучении морфологических особенностей нейтрофилов после их миграции из венозной крови в псориатическую папулу с учетом уровня экспрессии молекул адгезии. Материалы и методы Проведено клинико-иммунологическое обследование 82 больных (39 женщин и 43 мужчин) в возрасте от 20 до 60 лет, страдающих вульгарным и экссудативным псориазом в прогрессирующую и стационарную. Давность заболевания составила от 3 месяцев до 10 лет. В качестве контрольной группы обследованы 50 практически здоровых лиц (28 женщин и 22 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих на момент обследования острых хронических заболеваний или их обострения. Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г. с изменениями и дополнениями от 2008 г.). Количество нейтрофильных лейкоцитов определяли в мазке периферической крови, а также крови, полученной с поверхности псориатической папулы при получении феномена точечного кровотечения. Мазки крови фиксировали в смеси Никифорова, окрашивали по Романовскому-Гимзе, затем определяли процентное содержание нейтрофилов среди других лейкоцитов: эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов. Сегментограмму нейтрофилов изучали путем подсчета количества фрагментов ядра у 100 клеток. Индекс сегментации нейтрофилов изучали по формуле [1]: 1х+2х+3х+4х+5х Индекс сегментации = --------------- 100 , где х - количество сегментов в ядре нейтрофила. Венозную кровь для исследования брали утром натощак. На проточном цитометре FC-500 “Beckman Coulter”, (США) определяли содержание L-селектина (CD62L, FITC), LFA-1 (CD11a, FITC), LFA-3 (CD58, FITC), ICAM-1 (CD54, FITC), PECAM-1 (CD31, FITC) на нейтрофилах цельной крови. Статистическую обработку результатов проводили с помощью SPSS 13.0 for Windows. Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание проводили с помощью подсчета медианы (Мe) и межквартильного интервала (25 и 75 процентили). Вероятность различий оценивали по непараметрическом критериям Колмогорова-Смирнова (Z) и Вилкоксона (W). Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента корреляции Спирмена (ρ). Результаты Содержание нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных псориазом и в группе контроля было одинаковым - 56% (51;63) и 56% (49;62); Z = 0,65; р = 0,78. Изменения касались структуры сегментограммы (рис. 1). Статистически значимо увеличивалось количество 2-сегментных - с 12% (9;16) до 14% (10;23); Z = 1,4; p = 0,03 и 3-сегментных - с 38% (31;41) до 41% (34;48); Z = 1,44; p = 0,03 форм нейтрофилов, но снижалась концентрация нейтрофилов с 4-мя и более сегментами в ядре - с 31% (28;35) до 27% (22;34,3); Z = 1,63; p = 0,01. Эти изменения повлекли за собой снижение индекса сегментации нейтрофилов - с 3,38 (3,21;3,52) до 3,17 (2,96;3,43); Z = 2,16; p = 0,001. Несмотря на то, что в целом содержание нейтрофилов в периферической крови у больных псориазом и контрольной группой было одинаковым, различия заключались в увеличении концентрации 2- и 3-сегментных форм и снижении количества нейтрофилов с 4-мя и более сегментами в ядре. Непосредственно в очаге поражения (в псориатической папуле) концентрация нейтрофильных лейкоцитов заметно снижалась - с 56% (51;63) до 36,32% (22,86;43,02); W = -3,81; р = 0,001. В сегментограмме крови (рис. 2) нарастало содержание 2-сегментных форм нейтрофилов - с 14% (10;23) до 25,65% (17,29;35,57); W = -3,29; p = 0,001; в то время как концентрации 3- и 4-сегментоядерных форм нейтрофилов практически не изменялись - с 41% (34;48) до 40,66% (33,65;50,91); W = 0,78; p = 0,43 и с 27% (22;34) до 17,17% (7,27;27,45); W = -0,28; p = 0,77. Индекс сегментации имел тенденцию к снижению - с 3,17 (2,96;3,43) до 2,83 (2,46;3,04); W = -0,78; p = 0,43. Итак, несмотря на то, что изменений в содержании нейтрофилов периферической крови у больных псориазом по сравнению с группой контроля не наблюдалось, однако были выявлены статистически значимые изменения количества сегментов ядра в сегментограмме. Так, в псориатической папуле наблюдалось резкое снижение концентрации нейтрофилов на фоне нарастания содержание 2-сегментных форм в структуре сегментограммы, что повлекло за собой снижение индекса сегментации нейтрофилов. Учитывая, что процессы миграции клеток, в том числе и нейтрофильных лейкоцитов, связаны с молекулами адгезии, нами изучено содержание нейтрофилов венозной крови, имеющих молекулы адгезии у всех обследуемых. Выявлено, что в группе больных псориазом по сравнению с контролем, наблюдалась незначительная тенденция к увеличению содержания нейтрофилов, несущих молекулу L-селектина - с 65% (40,9;87,32) до 74,17% (39,07;89,61); Z = 0,53; p = 0,93; количество нейтрофилов, содержащих молекулу ICAM-1 и LFA-3, наоборот, имело тенденцию к снижению - с 55,74% (31,45;71,81) до 50,16% (23,38;76,27); Z = 0,65; p = 0,77 и с 94,11% (70,25; 98,29) до 86,95% (44,92;96,94); Z = 0,84; p = 0,46 соответственно. В отношении концентрации нейтрофилов, несущих молекулу LFA-1, различий не наблюдали как у больных, так и практически здоровых - 99,35% (93,56;100) и 98,37% (89,03;99,87); Z = 0,95; p = 0,32. Статистически значимое различие касалось снижения содержания нейтрофилов венозной крови у больных псориазом, несущих молекулу PECAM-1 - с 98,72% (92,09;99,53) до 93,44% (57,49;97,71); Z = 2,25; p = 0,001. Таким образом, статистически значимых различий в группе больных псориазом и практически здоровых в содержании нейтрофильных лейкоцитов венозной крови, несущих молекулы адгезии и участвующих в фазах роллинга и прочной адгезии, не регистрировали. Статистически значимое различие выявлено в снижении нейтрофилов, имеющих молекулу PECAM-1, у больных псориазом, с которой связана заключительная фаза трансмиграции. Корреляционный анализ на этапе «роллинга» у больных псориазом показал присутствие слабых статистически значимых корреляций между уровнем экспрессии L-селектина с концентрацией 1, 2 и 3-сегментных нейтрофилов. Напротив, между концентрацией нейтрофилов с L-селектином и содержанием 4-сегментных нейтрофилов статистически значимой корреляции не выявлено, что является отличием от контрольной группы, в которой определена связь между содержанием нейтрофилов с L-селектином и 4-сегментными нейтрофилами (см. таблицу). На этапе «прочной адгезии» количество нейтрофилов с молекулой LFA-1 с коррелировало с концентрацией 1-, 2-, 3-, 4-сегментных нейтрофилов как у больных псориазом, так и у практически здоровых лиц, с той разницей, что у больных псориазом наблюдалось ослабление корреляционных связей. Между содержанием нейтрофилов с рецепторами LFA-3 выявлены корреляции с концентрациями 1-, 2-, 3- и 4-сегментных нейтрофилов как у больных псориазом, так и у практически здоровых лиц. Существенные различия были отмечены в отношении нейтрофилов, экспрессирующих молекулу ICAM-1: у больных псориазом в отличие от контрольной группы регистрировались статистически значимые корреляции с содержанием 2-, 3- и 4-сегментных нейтрофилов. На этапе «трансмиграции» у практически здоровых лиц регистрировали статистически значимые корреляции между содержанием нейтрофилов, имеющими рецепторы PECAM-1 с концентрацией нейтрофилов, содержащих 1, 2, 3, 4 и более сегментов в ядре. У больных псориазом корреляционные связи ослабевали и даже отсутствовали в случае с нейтрофилами, содержащими 2 сегмента в ядре (см. таблицу). Обсуждение Итак, в прогрессирующую и стационарную стадии псориаза, циркулирующие нейтрофильные лейкоциты, имеют на своей поверхности молекулы адгезии - L-селектина, LFA-1, ICAM-1, LFA-3, PECAM-1. Если учитывать, что в сосудистом русле существуют два почти равных пула нейтрофилов: циркулирующий и пристеночный, и при заборе венозной крови сосчитывается только циркулирующий пул, можно полагать, что у больных псориазом, впрочем, как и в группе контроля, уже на уровне нейтрофилов циркулирующего пула имеются все необходимые возможности для трансмиграции [15]. При этом обращает внимание факт снижения количества нейтрофилов венозной крови, несущих данные молекулы адгезии, у больных псориазом, что может быть связано либо с уменьшением поступления их из красного костного мозга в кровь, либо повышением интенсивности их миграции из крови в ткань, в частности, в кожу. В случае снижения поступления нейтрофилов из красного костного мозга изменения в структуре сегментограммы касались бы резкого увеличения незрелых форм, т.е. односегментных нейтрофилов [2]. В соответствии с полученными данными, при псориазе, наоборот, регистрировали увеличение 2- и 3-сегментных форм, что, не подтверждает версию о снижении поступления нейтрофилов из красного костного мозга в периферическую кровь. В пользу повышенной миграционной активности нейтрофилов из периферической крови в псориатическую папулу может свидетельствовать наличие положительных статистически значимых корреляций между концентрациями 2- и 3-сегментных форм нейтрофилов с содержанием нейтрофилов с молекулами L-селектина, LFA-1, ICAM-1, LFA-3, PECAM-1. Резкое снижение концентрации нейтрофильных лейкоцитов после миграции в псориатическую папулу может отражать высокий уровень дезактивации нейтрофилов в очаге поражения кожи. Кроме того, обращает внимание факт, увеличения 2-сегментных форм нейтрофилов в крови, выделяемой с поверхности псориатической папулы. В этом случае, создается впечатление, что именно 2-сегментные нейтрофилы более устойчивы в очаге поражения, чем 3- или 4-сегментные. Таким образом, при псориазе наблюдается более усиленная миграция нейтрофилов из периферической крови, о чем свидетельствует снижение числа нейтрофилов с молекулами L-селектина, LFA-3, ICAM-1 и PECAM-1 на фоне увеличения доли 2- и 3-сегментных нейтрофилов при уменьшении содержания 4-сегментных форм. После миграции нейтрофилов в псориатическую папулу, резкое уменьшение концентрации нейтрофилов в целом, сопровождается увеличением доли 2-сегментных форм в структуре сегментограммы.

About the authors

S. L Kashutin

Northern State Medical University

Arkhangelsk, 163000, Russian Federation

Alexandra K. Sherstennikova

Northern State Medical University

Email: a.sherstennikova@yandex.ru
Northern State Medical University, Arkhangelsk, 163000, Russian Federation Arkhangelsk, 163000, Russian Federation

V. S Neklyudova

Northern State Medical University

Arkhangelsk, 163000, Russian Federation

V. I Nikolaev

North-Western State Medical University n.a. I.I. Mechnikov

Saint-Petersburg, 191015, Russian Federation

L. L Shagrov

Northern State Medical University

Arkhangelsk, 163000, Russian Federation

S. V Klyuchareva

North-Western State Medical University n.a. I.I. Mechnikov

Saint-Petersburg, 191015, Russian Federation

V. A Piryatinskaya

North-Western State Medical University n.a. I.I. Mechnikov

Saint-Petersburg, 191015, Russian Federation

References

Supplementary files