OVEREXPRESSION OF STAT4 - A POSSIBLE DIAGNOSTIC MARKER OF EARLY STAGES OF MYCOSIS FUNGOIDES

Full Text

Грибовидный микоз (ГМ) - хроническое лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся клональной пролиферацией и первичным накоплением опухолевых Т-лимфоцитов в коже. ГМ является наиболее частым (85-90%) заболеванием при Т-клеточных лимфомах кожи [1]. Заболеваемость ГМ в мире оценивают в 0,3-1,18 случая на 100 тыс. населения и она продолжает увеличиваться [2]. Классический ГМ - медленно прогрессирующее заболевание, развивающееся многие годы. Клинически ГМ может прогрессировать от зудящих пятен розово-красного цвета (Т1) или возвышающихся плоских инфильтративных красновато-синюшных бляшек (Т2) до куполообразных, с гладкой поверхностью опухолевых узлов буровато-красного цвета (Т3) или развития эритродермии (Т4) и вовлечения в патологический процесс других органов и систем. Согласно WHO-EORTC-классификации Т-КЛК (2016) [3] выделяют следующие подтипы ГМ: фолликулотропный, педжетоидный ретикулез и синдром гранулематозной вялой кожи. Помимо этого, описано 16 атипичных форм ГМ [4]. Диагноз грибовидного микоза устанавливают на основании клинических проявлений заболевания, гистологических (часто неоднократных) и иммунофенотипических исследований биоптатов из очагов поражения кожи в сочетании с молекулярно-генетическим анализом (определение реаранжировки гена γ-цепи Т-клеточного рецептора) [4]. Выявлено, что средний срок до установления диагноза, даже у больных классической формой ГМ, составляет около 5 лет, и может значительно удлиняться при других вариантах его течения [5]. На ранних стадиях ГМ дифференциальная диагностика достаточно сложна ввиду клинического сходства с некоторыми доброкачественными воспалительными дерматозами: псориазом, экземой, нейродермитом, красным отрубевидным лишаем Девержи. Наименее информативной в диагностическом плане является пятнистая стадия ГМ, дифференциальную диагностику которой проводят в первую очередь с мелко- и крупнобляшечным парапсориазом [4, 6]. Достоверность диагноза грибовидного микоза, подтвержденного только клиническими, гистологическими и иммуногистохимическими признаками, составляет 50-75% [7]. Вероятность установления диагноза ГМ молекулярно-биологическим методом (ПЦР-исследование для идентификации реаранжировки гена Т-клеточного рецептора) на поздних стадиях (IIВ-IV) составляет 90%, на ранних (I-IIA) - 50% [8]. Таким образом, в настоящее время отсутствуют надежные, более информативные и специфичные генетические маркеры для ранней диагностики ГМ. Молекулярно-генетические исследования, проведенные в последние годы, убедительно доказывают роль генетических факторов в инициации злокачественного процесса и развития опухоли. Патогенетические механизмы развития ГМ до конца не установлены, но в последнее время все большее значение придается микроокружению малигнизированных лимфоцитов. Считается, что клетки, окружающие опухоль, могут оказывать влияние на инициацию или течение опухолевого процесса [9]. К микроокружению малигнизированных лимфоцитов относятся Т-регуляторные (Трег) клетки, которые являются специализированной субпопуляцией Т-лимфоцитов, обладающие иммуносупрессивными свойствами. Они поддерживают гомеостаз иммунной системы, подавляя избыточную активность эффекторных Т-клеток в реакциях с чужеродными антигенами. Избыточная активность Трег клеток часто наблюдается при злокачественных новообразованиях [10]. Трег экспрессируют транскрипционный фактор FOXP3 (Forkhead Box Protein), важный для поддержания иммунологической толерантности [11]. Немаловажное значение имеет цитокиновый профиль, который у больных ГМ различается в зависимости от стадии заболевания. Если в начале развития ГМ преобладает экспрессия Th1-цитокинов, интерферона (IFN)γ и интерлейкинов (IL-2, IL-12), то в прогрессирующих стадиях происходит «сдвиг» к Th2-профилю (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) [12]. IL-12 - мощный противоопухолевый цитокин, основными эффектами которого являются увеличение продукции IFNγ, а также стимуляция роста и цитотоксичности активированных NK-клеток, CD8+ и CD4+ Т-клеток, смещение дифференцировки CD4+ Th0-клеток в сторону Th1-фенотипа [13]. Также установлено, что STAT-сигнальная система играет центральную роль в процессе канцерогенеза [14]. STATs (signal transducers and activators of transcription - сигнальные передатчики и активаторы транскрипции) - семейство из шести транскрибируемых факторов, которые фосфорилируются одной из четырех рецептор-связанных Янус-киназ (Janus kinases - JAKs) вследствие цитокиновой стимуляции (рис. 1). Значимость белков данного семейства в иммунных реакциях обусловлена их ядерным расположением, что обеспечивает возможность STAT3 прямо регулировать множество генов-мишеней в патогенезе ГМ, включая гены апоптоза (например, Bcl-2/Bax) и цитокинов (например, IL-5 и IL-13) [15]. По данным R. Nishikomori [16] экспрессия STAT4 играет ключевую роль в процессе дифференцировки Th1 вследствие цитокиновой стимуляции (IL-12), а также в последующем переходе от Th1- к Th2-фенотипу ГМ [17]. Цель исследования - изучение генетических маркеров (FOXP3, STAT4, IL-12B) для ранней диагностики грибовидного микоза. Материал и методы Под нашим наблюдением находилось 42 больных ГМ и БП, получавших терапию на базе Клиники кожных и венерических болезней им. В.А.Рахманова и ФГБУ «НМИЦ гематологии». Группу больных ГМ составили 29 пациентов, группу больных БП - 13 пациентов. Средний возраст пациентов группы ГМ составил 54 ± 4,5 года (от 28 до 80), из них было 15 (52%) мужчин и 14 (48%) женщин (соотношение 1,1:1). Средний возраст больных БП составил 56 ± 3,5 года (от 32 до 78 лет), из них было 7 (54%) мужчин и 6 (46%) женщин (соотношение 1,2:1). Группа контроля представлена 10 здоровыми лицами (средний возраст 44 ± 2,5 года). В группу БП были включены пациенты со следующими диагнозами: мелкобляшечный парапсориаз - 6 (46%) пациентов (рис. 2), крупнобляшечный - 7 (54%) (рис. 3). По клиническим стадиям ГМ больных распределили следующим образом: пятнистая - 12 (41%) больных (рис. 4), бляшечная - 8 (28%) (рис. 5), опухолевая - 6 (21%) (рис. 6), эритродермия - 3 (10%) (рис. 7). Стадирование ГМ осуществлялось согласно классификации TNM (tumor-node-metastasis) [3]. По стадиям заболевания больных распределили следующим образом: IA - 3 (10%), IB - 10 (34%), IIA - 6 (21%), IIB - 5 (17%), IIIA - 4 (14%), IVA - 1 (4%) больной. Для установления диагноза проводили клинический осмотр; морфологическое исследование кожи (часто неоднократное); иммуногистохимический метод (ИГХ) исследования кожи с изучением иммунофенотипов βF1+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD45RO+, CD20+, CD25+, CD117+ и индекса пролиферативной активности Ki-67; молекулярно-генетический метод с определением клональности по реаранжировке гена γ-цепи Т-клеточного рецептора с помощью ПЦР. Две трети исследуемой группы составили пациенты с верифицированным диагнозом ГМ на поздних стадиях (IIB-IVB). Определение уровня экспрессии генетических маркеров (FOXP3, STAT4, IL-12B) выполняли на базе Лаборатории медицинской генетики Института молекулярной медицины Сеченовского университета. Анализ экспрессии генов FOXP3, STAT4, IL-12B проводили методом TaqMan ПЦР-РВ с обратной транскрипцией в термоциклере для ПЦР-РВ (“Bio-Rad”, США) с использованием зондов TaqMan, меченых флюоресцентным красителем FAM (рис. 8). Зонды и праймеры предоставлены фирмой “Applied Biosystems”. В качестве эндогенного контроля использовали ген ACTB, меченный FAM. Объектами исследования были пораженные участки кожи больных ГМ, БП и здоровых лиц, взятые методом инцизионной биопсии (6 мм). Уровень экспрессии измеряли в относительных единицах (отн.ед.) относительно ACTB. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel 2003 и Statistica 6.0. Для сравнения данных между группами применяли U-критерий Манна-Уитни и Т-критерий Стьюдента. Для всех критериев и тестов различия признавали статистически значимыми при p < 0,05. Таблица частот встречаемости диагностических показателей была построена с помощью статистического непараметрического критерия - точного метода Фишера, независящего от характера распределения показателя. Результаты Средний срок до установления у пациентов диагноза ГМ составил 6,22 года, что свидетельствует о сложности диагностики на ранних стадиях заболевания. У 3 (16%) больных ГМ стадии IВ и IIА реаранжировка гена Т-клеточного рецептора отсутствовала, что может не противоречить диагнозу ГМ, так как результаты ПЦР-исследования не являются универсальным методом в начальных стадиях заболевания, и определение клональности не может быть интерпретировано без корреляции с морфологическими признаками и данными иммунофенотипирования инфильтратов, причем часто для этого требуются неоднократные повторные исследования. В ходе исследования выявлено, что уровень экспрессии гена STAT4 показал значительное (в 9 раз) повышение экспрессии мРНК транскриптов у больных ГМ (166 отн.ед.) по сравнению с больными БП (17,9 отн.ед.; p < 0,05) и в 553 раза - со здоровыми лицами (0,3 отн.ед.; p < 0,05). Анализ экспрессии гена FOXP3 показал у больных ГМ повышение экспрессии мРНК транскриптов FOXP3 (16,3 отн.ед.) в 5 раз по сравнению с группой с БП, однако это не является статистически значимым (3,2 отн.ед.; p > 0,05), и в 82 раза по сравнению со здоровыми лицами (0,2 отн.ед.; p < 0,05). Выявлена слабая экспрессия IL-12B в обеих анализируемых группах. Также было отмечено статистически значимое преобладание уровня экспрессии мРНК транскриптов STAT4 у больных пятнистой и бляшечной стадиями ГМ (180; 318) отн.ед. по сравнению с больными БП (17,9 отн.ед.; p < 0,05) и здоровыми лицами (0,3 отн.ед.; p < 0,05), а также его резкое снижение у больных эритродермической формой ГМ (7,19 отн.ед.) (табл. 1). По результатам проведенного нами исследования был определен список диагностических признаков, статистически значимо чаще встречающихся у больных ГМ по сравнению с больными БП (табл. 2). С помощью Байесовской последовательной диагностической процедуры была определена информативность комплекса информативных признаков, приведенных в табл. 2. При проведении скользящего экзамена на списке информативных признаков без включения в него признака «Уровень экспрессии STAT4» было получено 100% и 59,1% правильных отнесений к группе больных ГМ и БП соответственно. При проведении скользящего экзамена на списке диагностических признаков с включением в него признака «Уровень экспрессии STAT4» было получено 100 и 81,8% правильных отнесений к группе больных ГМ и БП соответственно. Обсуждение Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для ранней диагностики ГМ приобретает большое значение уровень экспрессии мРНК транскриптов STAT4, который статистически значимо преобладает у больных ГМ по сравнению с больными БП. I. Litvinov и соавт. [17] установили, что в ранних стадиях Т-КЛК отмечается повышенная экспрессия STAT4 по сравнению с кожей здоровых лиц. V. Johnson и соавт. [18] выявили, что при прогрессировании заболевания, когда начинает преобладать экспрессия Th2-фенотипа, наблюдается уменьшение экспрессии данного маркера, что согласуется с полученными нами данными. При этом авторы не выявили статистически значимого различия в уровне экспрессии STAT4 у больных БП и ранними стадиями ГМ. Вместе с тем выявляемая у всех больных экспрессия маркера Tрег-клеток FOXP3, а также IL-12B не является диагностически значимой при исследовании БП и ГМ и может интерпретироваться только как вспомогательный диагностический признак в совокупности с другими. По данным А.С. Жукова и соавт. [10] с помощью иммуногистохимического исследования установлено, что доля Трег-клеток от всех Т-лимфоцитов кожи у больных пятнистой стадией ГМ и БП статистически значимо не различается, что согласуется с полученными нами данными. Можно предположить, что многократное увеличение количества Трег-клеток в коже больных ГМ по сравнению со здоровыми лицами (группа контроля) позволяет рассматривать избыточное иммуносупрессивное действие этих клеток с позиции важного патогенетического фактора развития злокачественной пролиферации Т-лимфоцитов [10]. Дальнейшие исследования в области молекулярных и эпигенетических механизмов патогенеза JAK/STAT сигнального пути при ГМ смогут позволить разработать эффективные методы терапии. Выводы 1. У больных ГМ по сравнению с больными БП отмечается статистически значимое преобладание экспрессии STAT4 (p < 0,05). 2. Включение в список клинических, гистологических, иммуногистохимических признаков определение уровня экспрессии STAT4 повышает точность дифференциальной диагностики ГМ и БП с 59,1 до 81,8% соответственно. 3. Выявляемая у всех больных БП и ГМ экспрессия маркера Tрег-клеток FOXP3 и IL-12B не является диагностически значимой и может рассматриваться только как вспомогательный диагностический признак в совокупности с другими морфологическими проявлениями. Благодарности. Авторы выражают благодарность Олимпиевой С.П. за помощь в статистической обработке данных при написании статьи.

About the authors

O. Yu Olisova

V.A. Rakhmanov Department of Skin and Veneral Diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

119991, Moscow, Russian Federation

Ekaterina V. Grekova

V.A. Rakhmanov Department of Skin and Veneral Diseases of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: grekova_kate@mail.ru
postgraduate at the Department of Skin and Veneral Diseases n.a. V.A. Rakhmanov of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 119991, Moscow, Russian Federation 119991, Moscow, Russian Federation

L. G Gorenkova

National Medical Hematology Research Сenter

Moscow, 125167, Russian Federation

E. A Alekseeva

Laboratory of medical genetics, Institute of molecular medicine of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; Laboratory of epigenetics of Research Centre of Medical Genetics

119991, Moscow, Russian Federation; 115522, Moscow, Russian Federation

D. V Zaletayev

Laboratory of medical genetics, Institute of molecular medicine of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University; Laboratory of epigenetics of Research Centre of Medical Genetics

119991, Moscow, Russian Federation; 115522, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files