Биоорганическая химия

Разработка терапевтических антиген-специфических Т-клеточных рецепторов (TCR) требует комплексной доклинической оценки их функциональной активности. Один из подходов при разработке новых препаратов для клеточной терапии на базе антиген-специфических Т-лимфоцитов заключается в модификации аутологичных Т-лимфоцитов эндогенными Т-клеточными рецепторами. В настоящей работе рассмотрены современные лабораторные платформы, применяемые для оценки ключевых характеристик TCR: формирования иммунологического синапса, специфичности связывания с антигеном и аффинности, активации сигнальных путей, продукции цитокинов и цитотоксического потенциала. Особое внимание уделено созданию модельных линий Т-клеток, экспрессирующих трансгенные TCR, оптимизации HLA-контекста клеток-мишеней и применению мультипараметрических технологий для анализа иммунного ответа. Обсуждаются перспективы использования 3D-органоидных моделей для оценки функциональной активности трансгенных TCR в условиях, приближенных к физиологическим, а также прогнозирования их клинической эффективности. Представленные подходы формируют основу для рационального отбора рецепторов-кандидатов в целях их последующего применения для иммунотерапии опухолей и лечения хронических инфекций.

РНК-интерференция (RNAi) – эволюционно консервативный механизм подавления экспрессии генов, основанный на деградации мРНК под действием малых интерферирующих РНК (siRNA). Открытие этого механизма стало не только мощным инструментом для фундаментальных исследований в биологии, но и открыло новые перспективы для терапевтической медицины. С точки зрения эффективности и безопасности терапия с помощью siRNA представляет собой многообещающую альтернативу традиционным фармацевтическим подходам. В отличие от традиционных фармакологических методов, которые часто характеризуются системной токсичностью и низкой специфичностью, терапия на основе siRNA позволяет селективно подавлять гены, ассоциированные с патологиями, обеспечивая высокоточное воздействие и низкую токсичность. Особый интерес представляет применение siRNA для модуляции активности макрофагов – ключевых эффекторов врожденного иммунитета, играющих центральную роль в развитии фиброза печени. Благодаря высокой пластичности макрофаги способны поляризоваться в провоспалительный (M1) или противовоспалительный (M2) фенотипы, что определяет их вклад в прогрессирование или регресс фиброза. Эпигенетические модификации и подавление ключевых регуляторов поляризации (таких как EGR2, IRF5, IRF3, TLR4, HAS2) с помощью siRNA позволяют целенаправленно изменять их функциональное состояние. В данном обзоре систематизированы современные данные о роли макрофагов в патогенезе фиброза печени и перспективах использования siRNA-терапии для управления их активностью. Обсуждаются стратегии прецизионного воздействия на ключевые молекулярные мишени, что открывает новые возможности для разработки патогенетически обоснованных методов лечения.

В обзоре обобщены современные представления о неклассических каннабиноидных рецепторах, их сигнальных механизмах и роли в физиологических и патологических процессах. Эти рецепторы (GPR55, GPR18, GPR119 и др.) характеризуются тканеспецифичной экспрессией, способностью взаимодействовать с различными G-белками и лиганд-зависимой активацией сигнальных путей. GPR55 участвует в регуляции боли, ангиогенеза и онкогенеза; GPR18 модулирует воспалительные и метаболические процессы; GPR119 рассматривается как перспективная мишень для терапии сахарного диабета. Установлена способность этих рецепторов к гетеродимеризации, что усложняет их фармакологический профиль. Неклассические каннабиноидные рецепторы представляют собой многообещающие мишени для лечения социально значимых заболеваний, таких как рак, диабет и нейродегенеративные патологии. Однако их контекст-зависимая активность требует дальнейших исследований для создания селективных терапевтических агентов.

Дважды негативные (DN) CD3⁺CD4^-CD8^- T-лимфоциты представляют собой подгруппу неклассических периферических T-клеток. Хотя их представленность в периферической крови относительно невысока (3–5%), они играют важную роль при развитии воспалительных реакций, онкологических, аутоиммунных заболеваний и аллергической астмы. В настоящем исследовании мы охарактеризовали цитокиновый профиль CD3⁺CD4^-CD8^- DN T-клеток с помощью мультиплексной технологии с широкой панелью аналитов. Показано, что цитокиновый профиль провоспалительных αβTCR⁺CD161⁺ DN T-клеток включает цитокины TNFα, IFNγ, IL-3, IL-13 и IL-27, хемокины IL-8/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 и RANTES/CCL5, а также факторы роста M-CSF и GM-CSF.

Злокачественные опухоли при развитии способны формировать перииссивное микроокружение, влияющее на их дальнейший рост и развитие. Существенную роль в этом процессе играют опухоль-ассоциированные фибробласты. В настоящем исследовании мы использовали для создания подкожной мышиной опухоли инокуляцию совместной культуры раковых клеток и фибробластов для формирования опухолей, обогащенных клетками микроокружения. После формирования опухолевого узла проводили внутриопухолевое введение препарата, содержащего плазмиду с геном лиганда активирующих рецепторов иммунных контрольных точек ОХ40L под контролем промотора CMV. Для доставки в клетки плазмиду никапсулировали в полимерную оболочку на основе ПЭГ-ПЭИ-ТАТ. Мы оценивали влияние комплекса плазмиды, кодирующей ОХ40L, в поликатионной оболочке на рост опухолей. В предлагаемой модели мы искусственно обеспечивали присутствие фибробластов в опухоли, которые в определенной степени могут выполнять функцию развитого микроокружения. Опухоли, обогащенные фибробластами, как правило, обладали повышенной скоростью пролиферации. Однако при внутриопухолевом введении невирусного препарата, кодирующего ОХ40L, в такие опухоли мы наблюдали значительное увеличение количества животных с полностью регрессирующими опухолями, достигающего 25%. Предполагается, что введенные фибробласты могут выполвать антиген-презентирующую роль и/или служить дополнительным источником сигналов для активации иммунной системы.

На сегодняшний день в научной литературе представлено ограниченное число данных о взаимосвязи механотрансдукции, связанной с изменениями уровня зиксина, и биохимической передачи сигнала транскрипционного фактора YAP. Исследования в этой области предполагают, что стрессиндуцированная реорганизация активового цитокелета, опосредованная зиксином, может играть ключевую роль в механотрансдукции YAP. Вместе с тем эти работы не предоставляют четких результатов относительно влияния зиксина на распределение YAP между ядром и цитоплазмой и регуляцию его активности. В данной статье мы исследовали влияние зиксина на транслокацию эффектора Hippo-сигнального пути – YAP – в ядра клеток раннего эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Анализ ядерно-цитоплазматического распределения YAP с помощью иммуноблоттинга и иммуногистохимического окрашивания в сочетании с подавлением трансляции эндогенной мРНК зиксина морфолиновыми антисмысловыми олигонуклеотидами и сверхэкспрессией синтетической мРНК зиксина выявил стимулирующее влияние зиксина на транслокацию YAP в ядра клеток эмбрионов на стадии гаструлы, но не на стадиях бластулы и нейрулы. Аналогичный вывод был сделан в результате анализа влияния тех же изменений концентрации зиксина на экспрессию YAP-зависимого люциферазного репортера. На основании результатов нашего исследования, а также принимая во внимание известную роль зиксина как одного из механотрансдукторов, можно предположить, что этот белок участвует в механозависимой регуляции сигнального пути Hippo в эмбриональном развитии X. laevis на стадии гаструляции.

При лечении раковых заболеваний комбинированное действие фототермической и фотодинамической терапии обладает уникальными преимуществами по сравнению с каждым из этих методов в отдельности. В данном исследовании разработана многофункциональная адресная наноплатформа для одновременной комбинированной фототермической и фотодинамической терапии при облучении инфракрасным лазером 808 нм. Разработанная система представляет собой липосомы размером ~140 нм, специфичные к опухоль-ассоциированному антигену HER2 и загруженные гептаметинцианиновым красителем ближнего инфракрасного диапазона IR780. Тропность липосом к HER2 определяется HER2-специфичным скаффолдным белком DARPin_9-29 на внешней поверхности липосом. Установлено, что, находясь в составе липосом, IR780 сохраняет фототермические и фотодинамические свойства: под действием облучения в растворе липосом, загруженных IR780, происходит быстрое повышение температуры раствора (до 60°C за 60 с), а также идет выработка активных форм кислорода. В опытах in vitro установлено, что HER2-специфичные липосомы, содержащие IR780, обладают фотоиндуцированной цитотоксичностью в отношении HER2-суперэкспрессирующих клеток, вызывая гибель 50% клеточной популяции при концентрации 2.85 мкМ. Результаты исследования позволяют заключить, что HER2-специфичные липосомы, содержащие IR780, обладают отличными таргетными характеристиками, а IR780 может использоваться в качестве действующего вещества для одновременной фототермической и фотодинамической терапии.

Разработана эффективная система продукции изотопно-меченых гемсодержащих белков нейроглобина и цитохрома с человека. Получены соответствующие штаммы-продуценты, подобраны оптимальные условия культивирования: температура и продолжительность инкубации, состав сред, концентрация индуктора экспрессии. С помощью КД-спектроскопии в дальней и ближней УФ-видимой областях показано, что состав вторичной структуры ¹⁵N-нейроглобина близок к расчетному, а ориентация гема в молекулах преимущественно каноническая. Согласно двумерным ¹Н/¹⁵N-HSQC спектрам ЯМР нейроглобина и цитохрома с человека, белки свернуты в нативную конформацию с преобладанием α-спиральной структуры. Полученная система продукции может быть использована для наработки высокоочищенных препаратов тотально ¹⁵N/¹³C-меченых белков для проведения структурно-динамических исследований с использованием современных методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

Антиген PRAME (Preferentially expressed Antigen in Melanoma), относящийся к группе раковотестикулярных антигенов и экспрессирующийся в различных типах опухолей, представляет собой привлекательную мишень для направленной терапии онкологических заболеваний. В данной работе на основе моноклонального антитела 6Н8 к белку PRAME было получено гуманизированное антитело 6Н8Нu, которое было наработано в клетках CHO. Было показано, что гуманизированное антитело сохраняет высокую аффинность родительского мАТ по отношению к антигену (1.2 нМ), связывается как с рекомбинантным, так и с нативным белком PRAME, оказывает ингибирующее действие на пролиферацию PRAME+ клеточной линий меланомы человека Mel Ibr, а также ингибирует рост опухолевых узлов in vivo в степени, сравнимой с действием мышиного антитела 6Н8 и цитостатика мелфалана.

Известно, что даже непродолжительная диета с высоким содержанием жиров оказывает негативное влияние на метаболическое здоровье холоорганизма. Однако, под воздействием рациона, в первую очередь, претерпевает изменения микробиота кишечника. Тип диеты, биологически активные добавки и лекарственные препараты оказывают влияние как на таксономическое разнообразие микробиоты, так и на ее функциональное состояние. Известно, что при участии кишечной микробиоты триптофан подвергается превращению в индол и его различные производные. Также установлена ведущая роль индолов в регуляции экспрессии белков плотных контактов, а соответственно регуляции проницаемости кишечника. Целью нашего исследования была оценка влияния индол-3-ацетата на таксономическое разнообразие микробиоты тонкой и толстой кишки, а также установление потенциальной пребиотической ценности данного индольного производного в условиях кратковременного применения высокожировой диеты. Мыши C57/black6 SPF в возрасте 4–5 недель ( = 60, самки) случайным образом были распределены на шесть групп. Высокожировая диета была достигнута путем кормления лабораторных животных кормом с высоким содержанием жиров животного происхождения и обеспечивающей до 30% от общего количества калорий. Индол-3-ацетат применяли вместе со стандартной или высокожировой диетой через атраматический внутрижелудочный зонд в разовой дозе 0,1392 мг на мышь в течение 28 дней. В нашем исследовании впервые было показано, что у мышей C57/black6 SPF на кратковременной высокожировой диете индол-3-ацетат повышает представленность Bifidobacterium pseudolongum в микробном сообществе как тонкой кишки, так и толстой кишки. Тогда как повышение Akkermansia muciniphila было только в микробном сообществе толстой кишки. Прием индол-3-ацетата обеспечивает нормогликемию у животных на кратковременной высокожировой диете. Применение индол-3-ацетата при различных метаболических заболеваниях ассоциированных с высокожировой диетой и дисбактериозом может быть перспективным терапевтическим подходом к коррекции нарушений метаболизма через модуляцию микробиотического сообщества.

Впервые проведен анализ белков мембранной фракции психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum методом безметочной количественной хромато-масс-спектрометрии. При сравнении образцов из клеток, культивировавшихся при 10°С и при комнатной температуре, обнаружены существенные отличия в содержании многих белков, осуществляющих важнейшие физиологические процессы, включая ДНК- и РНК-связывающие белки, мембранные транспортеры, белки, обеспечивающие защиту от осмотического и окислительного стресса, и др. Результаты работы позволяют уточнить механизмы процессов, протекающих в мембранах клеток психротрофных бактерий при низких температурах, и дополняют существующие представления о стратегиях адаптации микроорганизмов, обитающих в многолетнемерзлых отложениях. Полученные данные также могут быть использованы для поиска потенциальных биокатализаторов, обладающих активностью при низких температурах.

Дрожжи Pichia pastoris (Komagataella phaffii) нашли широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности как микробные клеточные фабрики рекомбинантных белков за способность к гетерологической сверхэкспрессии многих целевых белков, в том числе протеолитических ферментов. Протеаза-активатор протеина С (PAPC) плазмы крови из микромицета Aspergillus ochraceus VKM F-4104D потенциально может быть внедрена в терапевтическую практику в качестве фибринолитического лекарственного средства, а также в диагностические системы для анализа свертываемости крови в роли основного компонента, активирующего протеин С. Для решения задач по применению протеазы-активатора протеина С в медицине и ветеринарии важно иметь надежную систему продукции рекомбинантного фермента. Такая система продукции может быть создана на основе дрожжей. Цель данной работы заключалась в создании штамма-продуцента PAPC на основе дрожжей P. pastoris и демонстрации успешной продукции и секреции протеолитического фермента в культуральную жидкость. Нами был сконструирован вектор, несущий ген papc. Этим вектором были трансформированы дрожжи P. pastoris, проведена селекция трансформантов на среде, содержащей антибиотик зеоцин. При помощи селекции на агаризованной среде с казеином, а также анализа культуральной жидкости методом белкового электрофореза в ПААГ были отобраны наиболее эффективные клоны-продуценты целевого фермента. Исследована динамика накопления активной формы PAPC в культуральной жидкости после индукции белкового синтеза при глубинном культивировании продуцирующего клона в колбе. LC-MS-анализ подтвердил присутствие фермента в культуральной среде, а также показал, что его накопление происходит в зрелой ферментативно активной форме. Полученный в результате работы штамм-продуцент может быть использован для дальнейшего получения экспериментальных промышленных партий фермента на биотехнологических производствах, поддерживающих проведение дрожжевой ферментации.

Ключевой компонент липидной платформы наночастиц для РНК-терапии – ионизируемые липиды. Они обеспечивают эффективную сборку комплекса липидов с нуклеиновой кислотой, ее защиту от преждевременной деградации, а после эндоцитоза способствуют выходу РНК в цитоплазму для дальнейшего процессинга. В работе описан синтез нового ионизируемого катионного липида на основе диглицеридного производного третичного алкиламина – [5-[1,2-ди(деканоилокси)пропан-3-илокси]пентил-(4-гидроксибутил)-амино]пентокси]-2-деканоилоксипропил]деканоат (An-1). Синтез отличается простотой и экономичностью применения реагентов. В сравнительных экспериментах с известным ионизируемым липидом ALC-0315 показано, что липид An-1 формирует сходные по размерам и эффективности включения модельной мРНК липидные наночастицы (ЛНЧ). ЛНЧ с мРНК зеленого флуоресцентного белка на основе липида An-1 эффективнее трансфицировали клетки в культуре по сравнению с ЛНЧ на основе липида ALC-0315. Предполагается, что новый ионизируемый липид может найти применение в производстве мРНК-вакцин.